نحن هنا وصف طريقة لتحضير كل واحد المكتبات نهاية القراءة ومرنا ، المقترنة تسلسل البورشيد التسلسل الجيني للتحليل بناء على تضخيم الحمض النووي الريبي T7 الخطية. هذا البروتوكول لا يتطلب سوى 10 نانوجرام من الحمض النووي الريبي ابتداء مجموع المكتبات ويولد متسقة للغاية تمثل النصوص كلها.
يستخدم الآن كله التسلسل transcriptome بواسطة تسلسل – مرنا على نطاق واسع لأداء عالمية التعبير الجيني ، الطفرة ، أليل محددة التعبير وغيرها من التحليلات الجينوم واسعة. تسلسل مرنا ، حتى يفتح الباب لتحليل التعبير الجيني للمورثات غير متسلسلة. مرنا ، يقدم تسلسل حساسية عالية ، ومجموعة كبيرة ديناميكية ويسمح بقياس الأرقام نسخ النص في العينة. البورشيد في الجينوم محلل يؤدي تسلسل لعدد كبير (> 10 7) من سلسلة قصيرة نسبيا يقرأ (<150 BP) ، والتسلسل و"إقران نهاية" النهج ، وفيه قراءة واحدة طويلة في كل أهدافها ، ويسمح لتعقب التقاطعات لصق بديل ، الإدراج والحذف ، ومفيد لتجميع دي transcriptome نوفو.
واحدة من التحديات الرئيسية التي تواجه الباحثين هو كمية محدودة من المواد ابتداء. على سبيل المثال ، في التجارب حيث يتم حصاد الخلايا بواسطة الليزر الدقيقة تشريح المتاحة بدءا مجموع RNA مالمنعم يوسف في قياس نانوجرام. وقد وصفت إعداد تسلسل مرنا – المكتبات من مثل هذه العينات 1 ، 2 ولكن ينطوي كبيرة PCR التضخيم التي قد أعرض عن التحيز. وقد نشرت الأخرى بناء مكتبة الرنا تسلسل الإجراءات مع الحد الأدنى من التضخيم PCR 3 ، 4 ، ولكنها تتطلب كميات ميكروغرام من الحمض النووي الريبي ابتداء الإجمالي.
نحن هنا وصف بروتوكول لمنصة الجينوم محلل البورشيد الثاني لتسلسل تسلسل مرنا ، لإعداد المكتبة التي تتجنب كبيرة PCR التضخيم ويتطلب سوى 10 نانوجرام من الحمض النووي الريبي الإجمالي. في حين وصفت في وقت سابق هذا البروتوكول والمصادقة على واحد في نهاية التسلسل 5 ، حيث تم عرض لانتاج مكتبات الاتجاه دون إدخال كبيرة التحيز التضخيم ، نحن هنا من صحة أكثر من ذلك لاستخدامها بوصفها بروتوكول نهاية المقترنة. نحن تضخيم انتقائي الرناوات رسول مذيل بعديد الأدينيلات بدءا من الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام الأسلوب يستند T7 Eberwine التضخيم الخطية ، صاغ "T7لوس انجليس "(T7 خطية التضخيم) ، وتضخيم بولي – A مجزأة mRNAs ، عكس كتب ومحول ligated لإنتاج مكتبة التسلسل النهائي. بالنسبة لكل من يعمل واحد نهاية القراءة والمقترنة ، يتم تعيينها لسلاسل transcriptome الإنسان (6) وتطبيع بحيث ويمكن مقارنة البيانات من تشغيل متعددة ، ونحن التقرير قياس التعبير الجيني في وحدات من النصوص لكل مليون (TPM) ، وهو مقياس متفوقة على RPKM عند مقارنة عينات 7.
البروتوكولات الحالية لجعل المكتبات نهاية الاقتران تتطلب ما بين 1 ميكروغرام 9-2،5 10 ميكروغرام كمية بدءا من الحمض النووي الريبي الإجمالي. نحن هنا حاضرنا التضخيم T7 خطية إلى (T7LA) طريقة واحدة لإعداد كلا البورشيد نهاية القراءة والمكتبات المقترنة التسلسل وتبين أن هذا الأسلوب يسمح للمكتبات من الجيل منخفضة تصل إلى 10 نانوغرام من الحمض النووي الريبي مجموع إنتاج البيانات التي يمكن أن تقارن من تضخيم الحد الأدنى (MinAmp) مصنوعة من مواد المكتبات أضعاف بدءا من 1000 (10 ميكروغرام RNA المجموع). المكتبات 10 نانوغرام لم يحدد فقط العدد الإجمالي للجينات مماثلة ، ولكن أيضا إنتاج التوقيعات التعبير الجيني التي تشبه (أرقام 3a و ب). وعلاوة على ذلك ، فإن كلا من واحدة نهاية القراءة والمكتبات المقترنة التي تنتجها T7LA طريقة مشابهة جدا لبعضها البعض (الشكل 3C) ، الذي يسمح للباحثين لمقارنة البيانات التي تم إنشاؤها من قبل المكتبات إما مصنوعة من البروتوكول. منذ أعدت هذه المكتبات من الحمض النووي الريبي الجنينية البشرية الخلايا الجذعية ، بحثنالمدة 30 جينات الخلايا الجذعية محددة بين المكتبات وجدت أن ما يقرب من تحديد جميع هذه الجينات (93-100 ٪) من المكتبات مصنوعة من لا يقل عن 10 نانوغرام من بدء RNA الكلي (الشكل 4) ، والمصادقة على البروتوكول وبالتالي لدينا. نعتقد بروتوكول لدينا ستكون مفيدة جدا للباحثين ، وخاصة في ظروف مثل الخلايا التي تم فرزها أو تدفق الليزر الدقيقة تشريح الأنسجة حيث بدأ يحد من المواد. في مثل هذه الظروف ، سيكون لدينا بروتوكول يسمح توليد بيانات قابلة للمقارنة في التعبير الجيني للمكتبات مصنوعة من كميات أكبر من ذلك بكثير منذ بدء بروتوكول لدينا تنتج ملامح التعبير للمقارنة بين ما لا يقل عن 3 أوامر من حجم بدءا من الحمض النووي الريبي.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا العمل من خلال تمويل من المعهد Morgridge للبحوث وجامعة ولاية ويسكونسن مؤسسة. نشكر كريستا إيستمان للمساعدة التحرير.
Company | Kit/Reagent | Catalog # | Special Comments |
Ambion | Fragmentation reagent | AM8740 | |
Ambion | Liner Acrylamide | AM9520 | |
Ambion | MEGAscript T7 Kit | AM1334 | |
Ambion | Non DEPC treated nuclease free water | AM9932 | |
Fermentas | dNTP set | R0181 | |
Fermentas | methylated dNTPs | R0431 | For Single Read sample prep only |
Illumina | TruSeq SR Cluster Generation kit v5 | GD-203-5001 | For Single Read sample prep only |
Illumina | TruSeq Seq Kit v5 36 cycles | FC-104-5001 | |
Illumina | Chip Seq Sample Prep Kit | IP-102-1001 | For Single Read sample prep only. Can be replaced with NEB DNA sample prep Master Mix Set 1 Cat# E6040S |
Illumina | TruSeq PE Cluster Generation kit v5 | PE-203-5001 | For paired end sample prep only |
Illumina | Paired End Sample Prep Kit | PE-102-1001 | For paired end sample prep only |
Invitrogen | 1kb plus ladder | 10787-018 | |
Invitrogen | E. coli Rnase H | 18021-014 | |
Invitrogen | Rnase Out | 10777-019 | |
Invitrogen | 2nd strand buffer 5x | 10812-014 | |
Invitrogen | E. coli DNA polymerase | 18010-017 | |
Invitrogen | E-gel SYBR safe 2% | G521802 | |
Invitrogen | Superscript III (with 5X FS buffer and 0.1M DTT) | 18080-085 | |
Invitrogen | Trizol | 12183555 | |
Invitrogen | RNA quibit assay kit | Q32852 | |
Invitrogen | dsDNA HS qubit assay kit | Q32851 | |
Invitrogen | E. coli DNA ligase | 18052-019 | |
Invitrogen | T4 DNA Polymerase | 18005-025 | |
Invitrogen | Ultra Pure Dnase Rnase water | 10977-015 | |
Invitrogen | Superscript II double stranded cDNA synthesis kit | 11917-020 | |
Invitrogen | Random Primer (invitrogen) | 48190-011 | For paired end sample prep only |
IDT | Not1Nonamer B primer | N/A | For Single Read sample prep only |
IDT | Oligo dT T7 | N/A | |
NEB | Not1 digestion kit | R0189S | For Single Read sample prep only |
Qiagen | Rneasy Minelute kit | 74204 | |
Qiagen | RNEasy Mini Kit (50) | 74104 | |
Qiagen | Gel purification kit | 28604 | |
Qiagen | Dnase set | 79254 | |
Qiagen | Rneasy MinElute kit | 74204 | |
Zymo Research | DNA clean and concentrator (250X) | D4014 |