היכרות עם מתח שאר בחקר הדבקה חיידקית

1. התא המארח האדם תרבית החיידקים תרבות HUVECs מעבר בין 1 ו – 9 ב 37 מעלות בתוך חממה humidified עם 5% (v / v) CO 2. מעבר התאים כאשר הם גישה מפגש 80% עם טריפסין / EDTA לספק תרבויות תחזוקה על 75 ס"מ 2 צלוחיות תרבות ותרבויות ניסיוני בתאי זרימה חד פעמיות (μ-שקופיות VI). משיכה בינוני מן צלוחיות להיות passaged, לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של PBS, לשלוף ולהחליף אותו עם 1.5 מ"ל של טריפסין / EDTA. אפשר לנתק את התאים בתרבית תאים החממה למשך 5 דקות בשעה 37 ° C. איסוף התאים עם 10 מ"ל של מדיום תרבית תאים לתוך צינור איסוף 15 מ"ל. גלולה התאים עם צנטריפוגה 5 דקות (ב g 200), בטמפרטורת החדר. להשעות את התאים מ"ל 4 של אנדו-SFM בתוספת 10% (v / v) FBS לספור אותם על חדר Malassez, על פי הוראות היצרן. הציגו 30 μl של 6 תאים 1×10 HUVEC לכל ההשעיה מ"ל לתוך התעלה (3×10 4 סה"כ) ולאפשר לתאים לדבוק במשך 3 שעות ב 37 מעלות ב חממה humidified עם אווירה של 5% (v / v) CO 2. הוספת נפח נוסף של 120 μl של אנדו-SFM למלא את הבארות. תאים צריכים להקים monolayer subconfluent (איור 2). לגדול נ meningitidis להביע GFP (במקרה הזה 8013 זן GFP להביע בשליטת היזם IPTG-ועין מתנהלת), על צלחות אגר GCB המכיל תוספים קלוג'ס 5 מיקרוגרם / מ"ל של chloramphenicol ב 37 ° C באווירה לחות המכיל 5% (v / v) CO 2 למשך 16 שעות. 2. הידבקות ראשונית של חיידקים בודדים לארח תאים התאם את הריכוז של חיידקים גדל על צלחות אגר GCB כדי OD600 של 0.05 עם טרום חימם Endo-SFM המכיל 10% (v / v) FBS ו דגירה של 120 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באווירה לחות המכיל 5% (v / v) CO 2, תחת רועד עדין (130 סל"ד). להשרות ביטוי של GFP על ידי הוספת 1 IPTG mM לתוך המדיום תרבות לתקופת הדגירה כולו. מניחים את הפנויה μ-Slide על הבמה של מיקרוסקופ הפוך מצויד פלטפורמה מחומם כדי לשמור על הטמפרטורה מדגם ב 37 ° C. יוצקים מראש חימם Endo-SFM בתוספת 2% (v / v) FBS לתוך כוס זכוכית סטרילית למלא מזרק 50 מ"ל סטרילי עם המדיום הזה. חבר את צינורות "כניסה" אל המזרק ומלא על ידי החדרת בינוני. חבר את "הכניסה" צינור אל Slide-μ, עם טיפול, כדי למנוע החדרת אוויר לתוך החדר. לאחר מכן, לצרף את "יציאה" הצינור לקצה השני בזהירות למלא את הערוץ עם בינוני עד מרחק של כ 1 ס"מ "יציאה" את החדר. מדוד את OD600 חיידקים להסתגל 0.15 ב Endo-SFM המכיל 2% (v / v) FBS. כדי להסתכל על חיידקים בודדים, אגרגטים כל חייב להיות מופרת על ידי vortexing נמרץ של המדגם חיידקי. מקום 100 μl של אנדו-SFM בתוספת 2% (v / v) FBS בינוני לתוך המאגר ולהוסיף 100 μl של הפתרון חיידקי נלקח מהחלק העליון של הפתרון vortexed להימנע הדגימה כל אגרגטים חיידקי הנותרים. בזהירות להציג את נפח 200 μl אל Slide-μ ידי סיבוב שסתום להזריק את החיידקים אל תוך החדר. הציגו Endo-SFM המכיל 2% (v / v) FBS, שמרו על 37 מעלות צלזיוס עם פלטפורמת מחוממת, החדרה באמצעות משאבת מזרק עם הלחץ גוזז תואם הידבקות של 0.044 dynes / 2 ס"מ במשך 15 דקות. ראו למשל וידאו או 1 דמות 3. לאחר שלב זה, או לעבור סעיפים 3, 4 או 6. 3. כימות של הידבקות ראשונית של חיידקים בודדים לתאי המארח לאחר הידבקות ראשונית במשך 15 דקות, לרכוש תמונות של עשרה שדות באקראי תוך הנוזל עדיין במחזור. ניתוח תמונות שנרכשו באמצעות תוכנת ImageJ 8, על מנת לקבל גישה המספר הממוצע של חיידקים adherant לכל שדה. הדבר נעשה באופן הבא: קודם כל, כל תמונה היא thresholded באמצעות "סף" חלון נמצא בתפריט "תמונה" כדי להדגיש את הפרט חיידקים פלורסנט דבקות, תוך מזעור רקע מהתאים. ואז, כל חיידק בודד נספרת, באמצעות Plug-In "מונה Cell" ( http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ). הנתונים עבור כל תמונה מדווחים גיליון אלקטרוני של Excel הם ממוצעים לכמת את מספר ממוצע של חיידקים חסיד לכל שדה. 4. מדידת התנגדות לזרימה של חיידקים בודדים חסיד לתאי המארח תוכנית מזרק משאבה הגדרת ליצור מתח גזירה החל 3-100 dynes / 2 ס"מ במשך 5 דקות. בתום 5 דקות, לרכוש ten שדות שנבחרו באקראי כמתואר בשלב 3.1, אבל עם הזרם נעצר יחסי ציבורIOR הרכישה. לנתח את התמונות רכשה כמתואר בשלב 3.2 ולכמת את המספר הממוצע של החיידקים הנותרים לכל שדה. 5. מדידת הצמיחה של חיידק חסיד מבודד microcolony הציגו Endo-SFM המכיל 10% (v / v) FBS, שמרו על 37 מעלות צלזיוס עם פלטפורמת מחוממת, החדרה באמצעות משאבת מזרק עם הלחץ גזירה נבחר למשך כמה שעות. הקלטת תמונות מיקרוסקופיה וידאו בזמן אמת על מסגרת אחת כל 5 דקות. בעקבות מיקרוסקופיה וידאו, להפסיק את הלחץ גזירה ידי כיבוי משאבת מזרק, לרכוש 2-3 תמונות נוספות ולאחר מכן לעצור את רצף רכישת התמונה על התוכנה. דוגמה של שגשוג חיידקים ניתן לראות וידאו 2. 6. מדידת התנגדות לזרימה של microcolonies חיידקי חסיד לאחר היווצרות של microcolonies גדול על פני הסלולר (step5.2) לרכוש 2-3 תמונות של תאים הן (לעומת שלב) חיידקים (על ידי ה-GFP-פלואורסצנטי) לפני יישום תזרים. במשך שארית של הניסוי, פרוטוקול הרכישה תפקח רק את הקרינה. החלת מתח גזירה גבוהה במשך 5 דקות (300-100 dynes / ס"מ 2) ותמונות שיא בכל מסגרת אחת כל 5 שניות. עצור את המתח גזירה ידי כיבוי משאבת מזרק, לרכוש 2-3 תמונות נוספות ולאחר מכן לעצור את רצף רכישת התמונה על התוכנה. בשלב הבא, להסיר את צינור "היציאה" הראשונה ובזהירות, כדי למנוע ריקון ערוץ ולאחר מכן להוסיף מראש חימם בינוני טרי למלא את בארות לפני הסרת צינורות "כניסה". כדי לקבוע כמותית את השפעת הלחץ גזירה על עמידות חיידקים, assay ציפוי יכול להתבצע כדלקמן: לאסוף את הנותרים בינוני לשטוף את μ-Slide פעמיים עם 120 μl של PBS, אשר מסיר את המדיום הנותרים מערוץ (שוטף הן ) נאסף גם. לנתק את התאים הנגועים עם תוספת של 50 μl של טריפסין / EDTA במשך 5 דקות ב 37 מעלות ו לערבב את זה עם מדגם מנותקת ההשעיה שנאסף בשלב הקודם. ביצוע דילולים סדרתי PBS ואת הצלחת שבריר 10 μl לצלחות GCB אגר, בשלושה עותקים, על מנת לקבוע את מספר יחידות המושבה להרכיב (CFU) ביום שלמחרת, לאחר דגירה של הצלחות ב 37 ° C באינקובטור עם 5% (v / v) CO 2. וידאו 3 ו -4 להשוות את המתח סוג בר עם מוטציה pilV. 7. ניתוק מן חיידקית microcolonies להדביק תאים בתא זרימה על ידי חזרה על שלבים 2.1-2.8 ולאפשר הזיהום להמשיך במשך 30 דקות. הסר חיידקים מאוגד על ידי הגדלת זרימת dynes 10 / 2 ס"מ לתקופה של 2 דקות ולאפשר זיהום להימשך 2h. צמצום זרימת 0.15 dynes / 2 ס"מ. כל שעה, לאסוף ירידה של מדיום יוצא של החדר לזרום. ביצוע דילולים סדרתי של דגימות צלחת אותם על צלחות אגר GCB. קביעת מספר יחידות המושבה להרכיב (CFU) ביום שלמחרת, לאחר דגירה של הצלחות ב 37 ° C באינקובטור עם 5% (v / v) CO 2. 8. נציג תוצאות איור 1: שלבים שונים של monolayer סלולרי שניתן לצפות ומדד בנוכחות זרימה בהליך. איור 2: monolayer תא האנדותל בחדר זרימה בתחילת הניסוי (היעדר לחץ גזירה). כ -50 לתאי אנדותל מאורגנים monolayer משנה ומחוברות. איור 3: ייצוג גרפי של הידבקות ראשונית של חיידקים על פני השטח הסלולר. ערכים עבור שלושת השדות מסומנים כדי לתת מושג על וריאציה בשדה אל השדה צפוי (0044 dynes / ס"מ 2). וידאו 1. ויזואליזציה של הידבקות ראשונית של חיידקים על monolayer הסלולר כפונקציה של זמן (0044 dynes / ס"מ 2). GFP-להביע את החיידקים הבאים את הכיוון של המדיום זורם. הסרט מואץ פי 60, את משך הזמן האמיתי של הסרט הוא 10 דקות. לחץ כאן כדי לראות את הוידאו. וידאו 2. החיידקים לאחר הדבקה ראשונית הורשו להתרבות על פני הסלולר לתקופה של 7 שעות (1000 מואץ פי). לחץ כאן כדי לראות את הוידאו. וידאו 3. לאחר הפצת נשק על פני השטח הסלולר המכונאיהתנגדות של אל microcolonies נבדק על ידי הגדלת רמת הלחץ גזירה dynes עד 10 / 2 ס"מ 5 דקות אבל microcolonies סוג בר עמידים מואץ פי 60. לחץ כאן כדי לראות את הוידאו. וידאו 4. Microcolonies שיצרו מוטנט pilV הם שיבשו להגביר את זרימת (10 dynes / ס"מ 2). מוטציה זו אינה מצליחה להשפיע על שיפוץ של קרום פלזמה תחת microcolonies ולכן היא יותר רגישה ללחץ מוגבר גזירה (וידאו מואץ פי 60) 5. לחץ כאן כדי לראות את הוידאו.