Introducing Schubspannung in der Studie der bakteriellen Adhäsion

1. Menschlichen Wirtszelle und Bakterienkultur Kultur HUVECs zwischen Passage 1 und 9 bei 37 ° in einem befeuchteten Inkubator mit 5% (v / v) CO 2. Passage der Zellen, wenn sie 80% Konfluenz Ansatz mit Trypsin / EDTA bis zur Wartung Kulturen auf 75 cm 2 Kulturflaschen und experimentellen Kulturen in Einweg-Flow Kammern (μ-Slides VI) liefern. Ziehen Medium aus den Flaschen zu passagiert werden, waschen Sie die Zellen mit 10 ml PBS, zurückzutreten und ersetzen Sie sie mit 1,5 ml Trypsin / EDTA. Lassen Sie die Zellen in einer Zellkultur-Inkubator für 5 Minuten lösen bei 37 ° C. Sammeln Sie die Zellen mit 10 ml Zellkulturmedium in eine 15 ml-Collection-Tube. Pellet die Zellen mit einem 5 Minuten Zentrifugation (bei 200 g), bei Raumtemperatur. Die Zellen in 4 ml Endo-SFM mit 10% (v / v) FBS und zählen sie auf einem Malassez Kammer nach den Anweisungen des Herstellers. Einführung 30 ul einer 1×10 6 HUVEC Zellen pro ml Suspension in den Kanal (3×10 4 insgesamt) und damit die Zellen für 3 Stunden bei 37 haften ° in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% (v / v) CO 2. Fügen Sie ein zusätzliches Volumen von 120 ul Endo-SFM in die Vertiefungen füllen. Die Zellen sollten bilden eine subkonfluenten Monoschicht (Abbildung 2). Wachsen Sie N. meningitidis, die GFP (in diesem Fall Stammes 8013, die GFP unter der Kontrolle eines IPTG-induzierbaren Promotor), auf GCB-Agarplatten mit Kellogg Ergänzungen und 5 ug / ml Chloramphenicol bei 37 ° C in einer feuchten Atmosphäre mit 5% (v / v) CO 2 für 16 Stunden. 2. Initial Haftung der einzelnen Bakterien an Wirtszellen Die Konzentration der Bakterien auf GCB Agarplatten zu einer OD600 von 0,05 gewachsen mit vorgewärmten Endo-SFM mit 10% (v / v) FBS und inkubieren für 120 Minuten bei 37 ° C in einer feuchten Atmosphäre mit 5% (v / v) CO 2, unter leichtem Schütteln (130 rpm). Induce GFP-Expression durch Zugabe von 1 mM IPTG in das Kulturmedium für die ganze Inkubationszeit. Legen Sie die Einweg-μ-Slide auf der Bühne eines inversen Mikroskops mit einem beheizten Plattform, um die Temperatur der Probe bei 37 ° C zu halten ausgestattet Gießen vorgewärmten Endo-SFM mit 2% (v / v) FBS in ein steriles Becherglas und füllen eine sterile 50 ml Spritze mit diesem Medium. Bringen Sie die "Eingabe"-Schlauch auf die Spritze und füllen Sie durch die Einführung Medium. Verbinden Sie den "Eintrag" Schlauch an den μ-Slide, mit Sorgfalt, um zu vermeiden, Einleiten von Luft in die Kammer. Dann füllen Sie das Anbringen der "exit" Rohr an das andere Ende und vorsichtig den Kanal mit mittleren bis ca. 1 cm Abstand von der Kammer "exit". Messen Sie die bakterielle OD600 und passen auf 0,15 in Endo-SFM mit 2% (v / v) FBS. Um an den einzelnen Bakterien aussehen, müssen alle Aggregate durch kräftiges Vortexen der bakteriellen Probe gestört werden. Platz 100 ul der Endo-SFM mit 2% (v / v) FBS-Medium in das Reservoir ergänzt und 100 ul der bakteriellen Lösung von der Oberseite des gevortext Lösung zu vermeiden, Probenahme alle verbleibenden bakteriellen Aggregaten genommen. Sorgfältig stellen die 200 ul Volumen in den μ-Slide, indem Sie den Hahn, um die Bakterien in die Kammer zu injizieren. Einführung Endo-SFM mit 2% (v / v) FBS, bei 37 ° C mit dem erhitzten Plattform, in die Kammer mit Hilfe einer Spritzenpumpe mit einer Schubspannung mit Adhäsion von 0,044 dyn / cm 2 für 15 Minuten. Siehe zum Beispiel Video-1 oder Abbildung 3 dargestellt. Nach diesem Schritt, entweder den § § 3, 4 oder 6 zu bewegen. 3. Die Quantifizierung der Anfangshaftung von einzelnen Bakterien an Wirtszellen Nach anfänglichen Haftung für die 15 Minuten, zu erwerben Bildern von zehn Feldern zufällig während Flüssigkeit immer noch im Umlauf ist. Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder mit dem ImageJ-Software 8, um die mittlere Anzahl der adherant Bakterien pro Feld zuzugreifen. Dies geschieht wie folgt: Zunächst einmal, jedes Bild wird Schwellenwert mit dem "Threshold"-Fenster in der "Bild"-Menü auf einzelne haftende fluoreszierende Bakterien zu markieren, bei gleichzeitiger Minimierung der Hintergrund aus den Zellen. Dann wird jedes einzelne Bakterium gezählt, mit dem Plug-In "Cell Counter" ( http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ). Die Daten für jedes Bild in einer Excel-Tabelle angegeben und sind gemittelt, um die mittlere Anzahl der adhärenten Bakterien pro Feld zu quantifizieren. 4. Die Messung der Strömungswiderstand einzelner Bakterien Anhänger Wirtszellen Programm der Spritzenpumpe Set-up zu Schubspannung zwischen 3 bis 100 dyn / cm 2 für 5 Minuten zu generieren. Am Ende der 5 Minuten zu erwerben zehn Felder zufällig gewählt, wie in Schritt 3.1 beschrieben, aber mit der Strömung gestoppt prior auf den Erwerb. Analysieren Sie die aufgenommenen Bilder wie in Schritt 3.2 beschrieben und quantifiziert die mittlere Anzahl der verbleibenden Bakterien pro Feld. 5. Die Messung des Wachstums eines isolierten Anhänger Bakterium zu einem Mikrokolonie Einführung Endo-SFM mit 10% (v / v) FBS, bei 37 ° C mit dem erhitzten Plattform, in die Kammer mit Hilfe einer Spritzenpumpe mit dem gewählten Schubspannung für mehrere Stunden. Bilder aufzeichnen für die Echtzeit-Video-Mikroskopie mit einem Bild alle 5 Minuten. Nach Video-Mikroskopie, stoppen Sie die Schubspannung durch Abschalten der Spritzenpumpe, erwerben 2-3 zusätzliche Bilder und beenden Sie den Bildaufnahme-Sequenz auf die Software. Ein Beispiel der bakteriellen Vermehrung kann auf Video 2 zu sehen. 6. Die Messung der Strömungswiderstand von anhaftenden Bakterien Mikrokolonien Nach der Bildung der großen Mikrokolonien auf der Zelloberfläche (step5.2) erwerben 2-3 Bilder der beiden Zellen (durch Phasenkontrast) und Bakterien (durch GFP-Fluoreszenz), bevor flow Anwendung. Für den Rest des Experiments wird die Übernahme-Protokoll-Monitor nur die Fluoreszenz. Die Anwendung hoher Scherspannung für 5 Minuten (300 bis 100 dyn / cm 2) und Aufnehmen von Bildern in einem Frame pro 5 Sekunden. Stoppen Sie die Schubspannung durch Abschalten der Spritzenpumpe, erwerben 2-3 zusätzliche Bilder und beenden Sie den Bildaufnahme-Sequenz auf die Software. Dann entfernen Sie den "exit"-Schlauch erste und sorgfältig zu vermeiden, das Leeren des Kanals und fügen Sie dann vorgewärmte frisches Medium in die Vertiefungen vor dem Entfernen der "entry"-Schlauch zu füllen. Zur quantitativen Bestimmung der Wirkung von Schubspannung auf bakterielle Resistenz kann eine Beschichtung Test wie folgt durchgeführt werden: collect die übrigen mittel-und waschen Sie die μ-Slide zweimal mit 120 ul PBS, die verbleibenden Medium entfernt vom Kanal (beide Waschungen werden auch gesammelt). Lösen Sie die infizierten Zellen mit der Zugabe von 50 ul von Trypsin / EDTA für 5 Minuten bei 37 ° und mischen dieses freistehende Probe mit der Suspension in den vorherigen Schritt gesammelt. Führen Sie serielle Verdünnungen in PBS und Platte eine 10 ul Bruchteil auf GCB Agarplatten, in dreifacher Ausfertigung, um die Anzahl der Kolonie bildenden Einheiten (KBE) auf den nächsten Tag zu bestimmen, nach der Inkubation der Platten bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5% (v / v) CO 2. Videos 3 und 4 vergleichen die Wildtyp-Stamm mit der pilV Mutante. 7. Bakterielle Loslösung von Mikrokolonien Zellen infizieren in der Strömungskammer durch Wiederholen der Schritte 2,1 bis 2,8 und damit die Infektion für 30 Minuten gehen. Entfernen ungebundenen Bakterien durch zunehmenden Durchfluss bis 10 dyn / cm 2 für einen Zeitraum von 2 Minuten und lassen Infektion für 2h weiter. Durchfluss reduzieren auf 0,15 dyn / cm 2. Jede Stunde, sammeln ein Tropfen des Mediums, die aus dem Strömungsraum. Führen Sie serielle Verdünnungen der Proben und die Platte sie auf GCB Agarplatten. Bestimmen Sie die Anzahl der Kolonie bildenden Einheiten (KBE) am nächsten Tag, nach Inkubation der Platten bei 37 ° C in einem Inkubator mit 5% (v / v) CO 2. 8. Repräsentative Ergebnisse Abbildung 1: Verschiedene Stufen eines zellulären Monoschicht, die beobachtet und gemessen werden kann in der Gegenwart fließen in das Verfahren. Abbildung 2: Endothelial Zellmonolayer in der Strömungskammer am Anfang eines Experiments (ohne Scherbeanspruchung). Etwa 50 Endothelzellen sind in einem sub-Monolayer organisiert. Abbildung 3: Grafische Darstellung der anfänglichen Anhaften von Bakterien auf der Zelloberfläche. Die Werte für die drei Felder sind angegeben, um eine Vorstellung von der Feld-zu-Feld-Variante, die zu erwarten (0044 dyn / cm 2) ist zu geben. Video 1. Visualisierung der anfänglichen Anhaften von Bakterien auf der zellulären Monoschicht als eine Funktion der Zeit (0044 dyn / cm 2). GFP-exprimierenden Bakterien sind nach der Richtung des strömenden Mediums. Der Film beschleunigt wird 60-fache, ist die wirkliche Dauer des Videos 10 Minuten. Klicken Sie hier, um das Video anzuschauen. Video 2. Nach anfänglichen Haftung Bakterien durften auf der Zelloberfläche vermehren für einen Zeitraum von 7 Stunden (beschleunigte 1000-fach). Klicken Sie hier, um das Video anzuschauen. Video 3. Nach Proliferation auf der Zelloberfläche der Mechanikeral Widerstand von Mikrokolonien wurde durch eine Erhöhung der Schubspannung auf 10 Dyn / cm 2 für 5 Minuten, aber Wildtyp Mikrokolonien sind beständig beschleunigt 60-fach getestet. Klicken Sie hier, um das Video anzuschauen. Video 4. Mikrokolonien durch die pilV Mutanten gebildet werden von Durchfluss zu erhöhen (10 dyn / cm 2) gestört. Diese Mutante nicht die Umgestaltung der Plasmamembran unter Mikrokolonien induzieren und ist somit sehr empfindlich auf erhöhte Schubspannung (Video ist 60-fach beschleunigt) 5. Klicken Sie hier, um das Video anzuschauen.