Apresentando tensão de cisalhamento em o Estudo da adesão bacteriana

1. Célula hospedeira humana e cultura bacteriana HUVECs cultura entre passagem 1 e 9 a 37 ° em uma incubadora umidificada com 5% (v / v) de CO 2. Passagem das células quando se aproximam de 80% confluência com tripsina / EDTA para fornecer culturas de manutenção em 75 cm 2 frascos de cultura e culturas experimentais em câmaras de fluxo descartáveis ​​(μ-Slides VI). Retirar médio dos frascos para ser várias passagens, lavar as células com 10 ml de PBS, retirar e substituí-lo com 1,5 ml de tripsina / EDTA. Permitir que as células para separar uma cultura de células em incubadora por 5 minutos a 37 ° C. Coletar as células com 10 ml de meio de cultura de células em um tubo de coleta de 15 ml. Agregar as células com uma centrifugação de 5 minutos (a 200 g), à temperatura ambiente. Suspender as células em 4 ml de Endo-SFM suplementado com 10% (v / v) FBS e contá-los em uma câmara de Malassez, de acordo com as instruções do fabricante. Introduzir 30 mL de uma 1×10 6 células por ml de suspensão HUVEC no canal (3×10 4 no total) e permitir que as células a aderir durante 3 horas a 37 ° em uma incubadora umidificada com uma atmosfera de 5% (v / v) de CO 2. Adicionar um volume adicional de 120 mL de Endo-SFM para encher os poços. Células devem formar uma monocamada confluentes (Figura 2). Crescer N. meningitidis expressando GFP (neste caso a tensão 8013 GFP expressar sob o controle de um promotor IPTG indutível), em placas de agar GCB contendo suplementos Kellogg e 5 mg / ml de cloranfenicol, a 37 ° C em uma atmosfera úmida contendo 5% (v / v) CO 2 durante 16 horas. 2. Adesão inicial de bactérias individuais para células hospedeiras Ajustar a concentração de bactérias cultivadas em placas de ágar GCB a um OD600 de 0,05 com pré-aquecido Endo-SFM contendo 10% (v / v) FBS e incubar por 120 minutos a 37 ° C em uma atmosfera úmida contendo 5% (v / v) de CO 2, sob agitação suave (130 rpm). Induzir a expressão GFP adicionando 1 mM IPTG para o meio de cultura para o período de incubação todo. Coloque o Slide-μ descartáveis ​​no palco de um microscópio invertido equipado com uma plataforma aquecida para manter a temperatura da amostra a 37 ° C. Despeje pré-aquecido Endo-SFM suplementado com 2% (v / v) FBS em um copo de vidro esterilizado e encher uma seringa estéril 50 ml com este meio. Anexar a "entrada" tubulação para a seringa e encher com a introdução médio. Conecte o "entrada" para o tubo μ Slide-, com cuidado, a fim de evitar a introdução de ar na câmara. Então, apor a "saída" do tubo para o outro lado e, cuidadosamente, encher o canal com média de aproximadamente 1 cm de distância da câmara "exit". Medir o OD600 bacteriana e ajustar para 0,15 em Endo-SFM contendo 2% (v / v) FBS. A fim de olhar para as bactérias individual, qualquer agregados deve ser interrompido por vórtex vigoroso da amostra bacteriana. ML colocar 100 de Endo-SFM suplementado com 2% (v / v) FBS médio para o reservatório e adicionar 100 ml da solução bacteriana tomadas a partir do topo da solução agitadas para evitar qualquer amostragem restantes agregados de bactérias. Cuidadosamente introduzir o volume de 200 mL para o μ Slide-girando a torneira para injetar a bactéria para dentro da câmara. Introduzir Endo-SFM contendo 2% (v / v) FBS, mantida a 37 ° C com a plataforma aquecida, para a câmara utilizando uma bomba de seringa com uma tensão de cisalhamento compatível com adesão de 0,044 dinas / cm 2 por 15 minutos. Ver, por exemplo video 1 ou figura 3. Após esta etapa, mova os pontos 3, 4 ou 6. 3. Quantificação da adesão inicial de bactérias individuais para células hospedeiras Após a adesão inicial de 15 minutos, adquirir imagens de dez campos aleatoriamente enquanto o líquido ainda está circulando. Analisar as imagens obtidas utilizando o software ImageJ 8, a fim de acessar o número médio de bactérias adherant por campo. Isto é feito da seguinte forma: em primeiro lugar, cada imagem é thresholded usando o "Threshold" janela encontrados no menu "Imagem" para destacar individuais aderir bactérias fluorescentes, minimizando o fundo das células. Então, cada única bactéria é contado, usando o Plug-In "Counter Cell" ( http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ). Os dados para cada imagem são relatados em uma planilha do Excel e são em média de quantificar o número médio de bactérias aderentes por campo. 4. Medir a resistência ao fluxo de bactérias individuais aderentes para células hospedeiras Bomba da seringa programa set-up para gerar tensão de cisalhamento variando 3-100 dinas / cm 2 por 5 minutos. No final dos 5 minutos, adquirir dez campos escolhidos aleatoriamente, conforme descrito no passo 3.1, mas com o fluxo interrompido prior à aquisição. Analisar as imagens obtidas como descrito no passo 3.2 e quantificar o número médio de bactérias remanescentes por campo. 5. Medir o crescimento de uma bactéria isolada aderente a um microcolony Introduzir Endo-SFM contendo 10% (v / v) FBS, mantida a 37 ° C com a plataforma aquecida, para a câmara utilizando uma bomba de seringa com o stress de cisalhamento escolhido por várias horas. Gravar imagens em tempo real microscopia de vídeo em um quadro a cada 5 minutos. Após microscopia de vídeo, parar a tensão de cisalhamento, desligando a bomba de seringa, adquirir 03/02 imagens adicionais e, em seguida, interromper a seqüência de aquisição de imagens do software. Um exemplo da proliferação bacteriana pode ser visto no vídeo 2. 6. Medir a resistência ao fluxo de aderentes microcolônias bacteriana Após a formação de microcolônias grandes na superfície celular (step5.2) 03/02 adquirir imagens de ambas as células (por contraste de fase) e bactérias (por GFP-fluorescência) antes da aplicação do fluxo. Para o resto do experimento, o protocolo de aquisição vai monitorar somente a fluorescência. Aplicação de tensão de cisalhamento alta por 5 minutos (300-100 dinas / cm 2) e gravar imagens em um quadro a cada 5 segundos. Parar a tensão de cisalhamento, desligando a bomba de seringa, adquirir 03/02 imagens adicionais e, em seguida, interromper a seqüência de aquisição de imagens do software. Em seguida, remover o "exit" tubo de primeira e com cuidado, para evitar o esvaziamento do canal e em seguida, adicione pré-aquecido meio fresco para encher os poços antes de remover a "entrada" da tubulação. Para determinar quantitativamente o efeito do estresse de cisalhamento sobre a resistência bacteriana, um ensaio de revestimento pode ser realizado da seguinte forma: recolher os restantes médio e lavar a μ Slide-duas vezes com 120 mL de PBS, que remove o meio restantes do canal (ambos lavagens são ) também coletados. Separar as células infectadas com a adição de 50 l de tripsina / EDTA por 5 minutos a 37 ° e misturar esta amostra isolada com a suspensão coletadas na etapa anterior. Realizar diluições em série em PBS e placa de uma fração 10 ml em placas de agar GCB, em triplicado, a fim de determinar o número de unidades formadoras de colônia (UFC), no dia seguinte, após a incubação das placas a 37 ° C em uma incubadora com 5% (v / v) de CO 2. Vídeos 3 e 4 comparam a estirpe selvagem com o mutante pilV. 7. Desapego bacteriana de microcolônias Infectar as células na câmara de fluxo, repetindo os passos 2.1 a 2.8 e permitem que a infecção se durante 30 minutos. Remover as bactérias não ligado, aumentando o fluxo para 10 dinas / cm 2 por um período de 2 minutos e permitir a infecção para continuar por 2h. Reduzir o fluxo para 0,15 dinas / cm 2. A cada hora, recolher uma gota de médios saindo da câmara de fluxo. Realizar diluições seriadas das amostras e da placa-los em placas de ágar GCB. Determinar o número de unidades formadoras de colônia (UFC), no dia seguinte, após a incubação das placas a 37 ° C em uma incubadora com 5% (v / v) de CO 2. 8. Resultados representativos Figura 1: Diferentes etapas de uma monocamada celular que pode ser observado e medido na presença de fluxo no processo. Figura 2: monocamada de células endoteliais na câmara de fluxo no início de um experimento (ausência de tensão de cisalhamento). Cerca de 50 células endoteliais são organizadas em uma monocamada sub-confluentes. Figura 3: Representação gráfica de adesão inicial de bactérias na superfície celular. Valores para três campos são indicados para dar uma idéia da variação de campo para campo, que é esperado (0.044 dinas / cm 2). Vídeo 1. Visualization de adesão inicial de bactérias na monocamada celular como uma função do tempo (0044 dinas / cm 2). Expressando GFP-bactérias estão seguindo a direção do fluído. O filme é acelerado 60 vezes, a duração real do vídeo é de 10 minutos. Clique aqui para ver o vídeo. Video 2. Depois de bactérias adesão inicial foram autorizados a se proliferar na superfície celular por um período de 7 horas (acelerada mil vezes). Clique aqui para ver o vídeo. Vídeo 3. Após Proliferação na superfície celular do mecânicoal resistência de microcolônias foi testada através do aumento do nível de tensão de cisalhamento a 10 dinas / cm 2 por 5 minutos, mas microcolônias tipo selvagem são resistentes acelerou 60 vezes. Clique aqui para ver o vídeo. Video 4. Microcolônias formado pelo mutante pilV são interrompidos por aumentar o fluxo (10 dinas / cm 2). Este mutante não induzir a remodelação da membrana plasmática sob microcolônias e é, portanto, mais altamente sensíveis ao aumento da tensão de cisalhamento (vídeo é acelerado 60 vezes) 5. Clique aqui para ver o vídeo.