Introductie van Shear Stress in de studie van bacteriële hechting

1. Menselijke gastheer cel en bacteriecultuur Cultuur HUVEC tussen passage 1 en 9 bij 37 ° in een bevochtigde incubator met 5% (v / v) CO 2. Passage van de cellen als ze 80% confluentie aanpak met trypsine / EDTA onderhoud culturen leveren op 75 cm 2 cultuur flessen en experimentele culturen in wegwerp stromingskamers (μ-Slides VI). Terug te trekken medium van de kolven te worden gepasseerd, was de cellen met 10 ml PBS, te trekken en te vervangen door 1,5 ml trypsine / EDTA. Laat de cellen in een celkweek incubator los gedurende 5 minuten bij 37 ° C. Het verzamelen van de cellen met 10 ml celkweekmedium in een 15 ml collectie buis. Pellet de cellen met een 5 minuten centrifugeren (bij 200 g), bij kamertemperatuur. Hang de cellen in 4 ml van de Endo-SFM aangevuld met 10% (v / v) FBS en ze op een Malassez kamer tellen, volgens de instructies van de fabrikant. Introduceer 30 pi van een 1×10 6 HUVEC cellen per ml suspensie in het kanaal (3×10 4 in totaal) en laat de cellen gedurende 3 uur bij 37 ° zich in een vochtige incubator met een atmosfeer van 5% (v / v) CO 2. Voeg een extra volume van 120 ul van de Endo-SFM om de putten te vullen. De cellen moeten vormen een subconfluent monolaag (figuur 2). Grow N. meningitidis uiten van GFP (in dit geval stam 8013 tot uitdrukking GFP onder de controle van een IPTG-induceerbare promotor), op GCB agarplaten die Kellogg's supplementen en 5 ug / ml chlooramfenicol bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer met 5% (v / v) CO 2 voor 16 uur. 2. De eerste hechting van individuele bacteriën aan gastheercellen Stel de concentratie van bacteriën gekweekt op GCB agar platen om een ​​OD600 van 0,05 met voorverwarmd Endo-SFM met 10% (v / v) FBS en incubeer gedurende 120 minuten bij 37 ° C in een vochtige atmosfeer met 5% (v / v) CO 2, onder zacht schudden (130 rpm). Induceren GFP expressie door toevoeging van 1 mM IPTG in het kweekmedium voor de hele incubatietijd. Plaats de wegwerp μ-Slide op het podium van een omgekeerde microscoop uitgerust met een verwarmd platform om het monster temperatuur op 37 ° C. Giet voorverwarmde Endo-SFM aangevuld met 2% (v / v) FBS in een steriele glazen beker en vul een steriele 50 ml spuit met dit medium. Bevestig de "intrede" slang aan de spuit en vul door de invoering van medium. Sluit de "intrede" slang aan op de μ-Slide, met zorg, om te voorkomen dat er lucht in de kamer. Vervolgens brengt de "exit" tube naar de andere kant en zorgvuldig vullen het kanaal met medium tot ongeveer 1 cm afstand van de kamer "exit". Meet de bacteriële OD600 en aan te passen aan 0,15 in de Endo-SFM met 2% (v / v) FBS. Om te kijken naar de individuele bacteriën, moet elke aggregaten worden verstoord door krachtige vortexen van de bacteriële monster. Plaats 100 pi van Endo-SFM aangevuld met 2% (v / v) FBS medium in het reservoir en voeg 100 ul van de bacteriële oplossing genomen vanaf de top van de gevortexed oplossing om te voorkomen dat sampling de resterende bacteriële aggregaten. Voorzichtig introduceren van de 200 ul volume in de μ-Slide door te draaien aan de kraan om de bacteriën te injecteren in de kamer. Introduceer Endo-SFM met 2% (v / v) FBS, gehandhaafd op 37 ° C met de verwarmde platform, in de kamer met een injectiespuit pomp met een schuifspanning compatibel is met de hechting van 0.044 dyne / cm 2 gedurende 15 minuten. Zie bijvoorbeeld video 1 of figuur 3. Na deze stap, ofwel te verplaatsen naar secties 3, 4 of 6. 3. Kwantificering van de initiële hechting van individuele bacteriën aan gastheercellen Na de eerste hechting gedurende 15 minuten, willekeurig te verwerven beelden van tien velden, terwijl vloeistof is nog steeds in omloop. Analyseren van de verkregen beelden met behulp van de software ImageJ 8, om het gemiddelde aantal adherant bacteriën per veld te gaan. Dit gebeurt als volgt: in de eerste plaats, elk beeld is thresholded met de "Threshold" venster te vinden in de "Image" menu aan de individuele naleven fluorescerende bacteriën te markeren, terwijl het minimaliseren van de achtergrond van de cellen. Vervolgens wordt elke bacterie geteld, met behulp van de Plug-In "Cell Counter" ( http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ). De gegevens voor elk beeld worden gerapporteerd in een Excel-spreadsheet en zijn gemiddeld bij het gemiddelde aantal van het aanklevende bacteriën per veld te kwantificeren. 4. Het meten van de weerstand tegen stroom van individuele bacteriën aanhanger van gastheercellen Programmeer de injectiepomp set-up op shear stress, variërend 3-100 dynes / cm 2 gedurende 5 minuten te genereren. Aan het eind van de 5 minuten, te verwerven tien velden willekeurig gekozen zoals beschreven in stap 3.1, maar met de stroom mee gestopt prIOR aan de overname. Analyseren van de verkregen beelden zoals beschreven in stap 3.2 en kwantificeren van het gemiddelde aantal van de resterende bacteriën per veld. 5. Het meten van de groei van een geïsoleerde bacterie aanhanger naar een microcolony Introduceer Endo-SFM met 10% (v / v) FBS, gehandhaafd op 37 ° C met de verwarmde platform, in de kamer met behulp van een spuitpomp met de gekozen schuifspanning voor meerdere uren. Beelden opnemen voor real-time video microscopie op een frame om de 5 minuten. Volgende video microscopie, de shear stress te stoppen door het uitschakelen van de injectiepomp, verwerven max. 2-3 beelden en stop vervolgens de afbeelding overname volgorde op de software. Een voorbeeld van bacteriële proliferatie is te zien op video 2. 6. Het meten van de weerstand tegen doorstroming van het aanklevende bacteriële microkolonies Na de vorming van grote microkolonies op het celoppervlak (step5.2) te verwerven 2-3 beelden van beide cellen (door de fase-contrast) en bacteriën (door GFP-fluorescentie) voordat stroom applicatie. Voor de rest van het experiment, zal de overname protocol te controleren alleen de fluorescentie. Het toepassen van een hoge schuifspanning gedurende 5 minuten (300-100 dynes / cm 2) en de opnamen op een frame om de 5 seconden. Stop de schuifspanning door het uitschakelen van de injectiepomp, verwerven max. 2-3 beelden en stop vervolgens de afbeelding overname volgorde op de software. Vervolgens verwijdert u eerst de "exit" slangen en zorgvuldig om te voorkomen dat het legen van het kanaal en voeg vervolgens voorverwarmde vers medium om de putten te vullen voordat u de "entry" slang. Kwantitatief te bepalen van het effect van shear stress op de bacteriële resistentie, kan een plating test worden uitgevoerd als volgt: het verzamelen van de resterende medium en twee keer was de μ-Slide met 120 pi PBS, die de resterende medium verwijderd is van het kanaal (beide wast zijn ook verzameld). Maak de geïnfecteerde cellen met de toevoeging van 50 ul van trypsine / EDTA gedurende 5 minuten bij 37 ° en meng deze vrijstaande monster met de ophanging verzameld in de vorige stap. Voer seriële verdunningen in PBS en de plaat een 10 ul fractie op GCB agar platen, in drievoud, in om het aantal kolonievormende eenheden (CFU) vast te stellen op de volgende dag, na incubatie van de platen bij 37 ° C in een incubator met 5% (v / v) CO 2. Video's 3 en 4 vergelijken met de wild-type stam met de pilV mutant. 7. Bacteriële onthechting van microkolonies Cellen infecteren in de stroom kamer door het herhalen van de stappen 2,1 tot 2,8 en laat de infectie door te gaan gedurende 30 minuten. Verwijder de niet-gebonden bacteriën door toenemende stroom tot 10 dynes / cm 2 gedurende een periode van 2 minuten en laat infectie te blijven voor 2u. Verminder stroom naar 0,15 dynes / cm 2. Elk uur, verzamelen een druppel medium coming out van de flow kamer. Voer seriële verdunningen van de monsters en de plaat ze op GCB agar platen. Bepaal het aantal kolonievormende eenheden (CFU) op de volgende dag, na incubatie van de platen bij 37 ° C in een incubator met 5% (v / v) CO 2. 8. Representatieve resultaten Figuur 1: Verschillende stappen van een cellulaire monolaag die kan worden waargenomen en gemeten in de aanwezigheid van stroming in de procedure. Figuur 2: endotheelcellen monolayer in de stroom kamer aan het begin van een experiment (afwezigheid van shear stress). Ongeveer 50 endotheelcellen zijn georganiseerd in een sub-samenvloeiend monolaag. Figuur 3: Grafische weergave van de initiële hechting van bacteriën op het celoppervlak. De waarden voor drie velden zijn aangeduid om een idee van het veld-to-veld variatie die wordt verwacht (0044 dynes / cm 2) te geven. Video 1. Visualisatie van de initiële hechting van bacteriën op de cellulaire monolaag als een functie van de tijd (0044 dynes / cm 2). GFP expressie bacteriën zijn in de richting van het stromende medium. De film wordt versneld 60-voudig, de werkelijke duur van de video is 10 minuten. Klik hier om de video te bekijken. Video 2. Na de initiële hechting bacteriën mochten prolifereren op het celoppervlak voor een periode van 7 uur (versnelde 1000-voudig). Klik hier om de video te bekijken. Video 3. Na proliferatie op het celoppervlak van de monteural weerstand van microkolonies werd getest door het verhogen van de shear stress niveau om 10 dynes / cm 2 gedurende 5 minuten, maar wild-type microkolonies zijn resistent versneld 60-voudig. Klik hier om de video te bekijken. Video 4. Microkolonies gevormd door de pilV mutant worden verstoord door flow te verhogen (10 dynes / cm 2). Deze mutant niet aanzet tot de verbouwing van het plasmamembraan onder microkolonies en is dus meer zeer gevoelig voor hogere shear stress (video is 60-voudig versnelde) 5. Klik hier om de video te bekijken.