Представляем напряжения сдвига в изучении бактериальной адгезии

1. Человек клетки-хозяина и бактериальной культуры Культура HUVECs между прохождением 1 и 9 при 37 ° во влажной инкубаторе с 5% (объем / объем) CO 2. Прохождение клеток, когда они приближаются к 80% слияния с трипсин / ЭДТА по содержанию культур на 75 см 2 колбах культуры и экспериментальных культур в одноразовых камерах потока (μ-Слайды VI). Вывод среды из колб для пассировать, мыть клетки с 10 мл PBS, отозвать и заменить его на 1,5 мл трипсин / ЭДТА. Разрешить клетки отделить в культуре клеток инкубаторе в течение 5 минут при температуре 37 ° C. Сбор клеток с 10 мл клеточной среде культуры в 15 трубке коллекции мл. Гранул клеток с 5 минут центрифугирования (на 200 г), при комнатной температуре. Приостановить клетки в 4 мл Эндо-SFM с добавлением 10% (объем / объем) FBS и считать их на камеру Malassez, в соответствии с инструкциями производителя. Ввести 30 мкл 1×10 6 HUVEC клеток на мл суспензии в канале (3×10 4 общего числа) и позволяют клеткам придерживаться в течение 3 часов при температуре 37 ° во влажной инкубатор атмосфере 5% (объем / объем) CO 2. Добавить дополнительный объем 120 мкл Эндо-SFM для заполнения скважин. Клетки должны стать subconfluent монослоя (рис. 2). Расти Н. meningitidis выражения GFP (в этом случае напряжение 8013 выражения GFP под контролем IPTG индуцируемый промотор), на GCB пластин агара, содержащего добавки Kellogg и 5 мкг / мл хлорамфеникола при 37 ° C во влажной атмосфере, содержащей 5% (об. / г) CO 2 в течение 16 часов. 2. Первоначальная адгезия отдельные бактерии к клеткам хозяина Отрегулируйте концентрацию бактерий, выращенных на пластинах GCB агар для OD600 в 0,05 с подогретого Эндо-SFM, содержащей 10% (объем / объем) FBS и инкубировать в течение 120 минут при температуре 37 ° C во влажной атмосфере, содержащей 5% (об. / г) CO 2, при легком встряхивании (130 оборотов в минуту). Вызвать GFP выражение добавлением 1 мМ IPTG в питательной среде в течение всего периода инкубации. Место одноразовые μ-Slide на сцене инвертированный микроскоп оснащен подогревом платформы для поддержания температуры образца при 37 ° C. Налейте подогретого Эндо-SFM с добавлением 2% (объем / объем) FBS в стерильный стакан стекло и заполняют 50 мл стерильного шприца с этой средой. Прикрепить "вступления" НКТ шприц и заполнить путем введения среды. Подключить «входа» трубки к μ-Slide, с осторожностью, чтобы избежать введения воздуха в камере. Затем прикрепить "выход" трубки на другом конце и тщательно заполнить канал со средним и примерно 1 см от камеры «выход». Мера бактериальных OD600 и приспосабливаться к 0.15 в Эндо-SFM, содержащей 2% (объем / объем) FBS. Для того, чтобы смотреть на отдельные бактерии, любые агрегаты должны быть нарушен энергичным вортексе бактериальной образца. Разместить 100 мкл Эндо-SFM с добавлением 2% (объем / объем) FBS среды в резервуаре и добавить 100 мкл бактериальной решения взяты из верхней части встряхивали решение, чтобы избежать выборки оставшиеся бактериальных агрегатов. Осторожно ввести 200 мкл в μ-Slide, повернув кран для введения бактерий в камере. Ввести Эндо-SFM, содержащей 2% (объем / объем) FBS, поддерживается на уровне 37 ° С с подогревом платформы, в камеру при помощи шприца насос с напряжением сдвига совместимы с адгезию 0,044 дин / см 2 в течение 15 минут. См., например, видео 1 или рисунке 3. После этого шага, либо переехать в разделах 3, 4 или 6. 3. Количественная оценка начальной адгезии отдельные бактерии к клеткам хозяина После начальной адгезии в течение 15 минут, как получить изображения из десяти полей случайно в то время как жидкость по-прежнему циркулирует. Анализ полученных изображений использованием программного обеспечения ImageJ 8, чтобы получить доступ к среднему числу adherant бактерий на поле. Это делается следующим образом: во-первых, каждое изображение thresholded использовании "Порог" окно, найденное в "Изображение" меню, чтобы выделить отдельные придерживаясь люминесцентные бактерии, минимизируя при этом фоне из клеток. Затем, каждую бактерию считается, с помощью Plug-In "Cell Counter" ( http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ). Данные для каждого изображения представлены в таблице Excel и усредняются количественно среднее число бактерий приверженцем на поле. 4. Измерение сопротивления потоку отдельных бактерий приверженцем к клеткам хозяина Программа шприцевой насос настройки для создания напряжения сдвига в пределах от 3 ​​до 100 дин / см 2 в течение 5 минут. В конце 5 минут, приобрести десять полей случайно выбранных, как описано в пункте 3.1, но с потоком остановился пр.IOR с приобретением. Анализ полученных изображений, как описано в пункте 3.2 и количественно среднее число оставшихся бактерий на поле. 5. Измерение роста изолированных приверженцем бактерии микроколония Ввести Эндо-SFM, содержащей 10% (объем / объем) FBS, поддерживается на уровне 37 ° С с подогревом платформы, в камеру при помощи шприца насос с выбранным напряжением сдвига на несколько часов. Запись изображений для видео в реальном времени микроскопии на один кадр каждые 5 минут. После видео-микроскопии, остановить касательное напряжение, отключив шприцевой насос, приобретают 2-3 дополнительных изображений, а затем остановить последовательность получения изображения на программное обеспечение. Например бактериального распространения можно увидеть на видео 2. 6. Измерение сопротивления потоку приверженцем бактериальных микроколоний После формирования крупных микроколоний на клеточной поверхности (step5.2) приобретают 2-3 образы обеих ячейках (по фазового контраста) и бактерий (по GFP-флуоресценции) перед потоком приложения. Для остальной части эксперимента, приобретение протокол будет следить только флуоресценции. Применение высоких касательное напряжение в течение 5 минут (3-100 дин / см 2) и запись изображений на один кадр каждые 5 секунд. Стоп напряжения сдвига, отключив шприцевой насос, приобретают 2-3 дополнительных изображений, а затем остановить последовательность получения изображения на программное обеспечение. Затем удалите "выход" трубы первого и осторожно, чтобы избежать опорожнения канала, а затем добавить подогретого свежей средой для заполнения скважины, прежде чем снимать "вступления" трубок. Чтобы количественно определить влияние касательное напряжение на бактериальной резистентности, покрытие анализ может быть выполнен следующим образом: собирать оставшиеся средних и мыть μ-Slide в два раза с 120 мкл PBS, который удаляет оставшиеся среды из канала (как моет являются Также собраны). Отсоедините инфицированных клеток с добавлением 50 мкл трипсин / ЭДТА в течение 5 минут при 37 ° и смешать это отдельный образец с подвеской, собранных в предыдущем шаге. Выполните серийные разведения в PBS и пластиной 10 мкл долю на тарелки GCB агар, в трех экземплярах, в целях определения количества колониеобразующих единиц (КОЕ) на следующий день, после инкубации пластин при 37 ° C в инкубаторе с 5% (объем / объем) CO 2. Видео 3 и 4 сравнить дикого типа с pilV мутанта. 7. Бактериальные отрыв от микроколоний Инфицировать клетки в проточную камеру, повторив шаги 2,1 до 2,8 и позволяют инфекции проводили в течение 30 минут. Удаление несвязанных бактерий за счет увеличения потока до 10 дин / см 2 в течение 2 минут и дайте инфекции продолжаться в течение 2 часов. Сокращение потока до 0,15 дин / см 2. Каждый час, собирать капли среду выходит из потока камеры. Выполните серийные разведения образцов и пластины их на тарелки GCB агара. Определить количество колониеобразующих единиц (КОЕ) на следующий день, после инкубации пластин при 37 ° C в инкубаторе с 5% (объем / объем) CO 2. 8. Представитель результаты Рисунок 1: Различные шаги сотовой монослоя, которые можно наблюдать и измерять в присутствии потока в порядке. Рисунок 2: Эндотелиальная монослоя ячейку в проточную камеру в начале эксперимента (отсутствие напряжения сдвига). Около 50 эндотелиальных клеток организованы в суб-сливающийся монослой. Рисунок 3: Графическое представление начальную адгезию бактерий на клеточной поверхности. Значения для трех полей указаны, чтобы дать представление о поле до изменения поля, которые, как ожидается, (0044 дин / см 2). Видео 1. Визуализация начальную адгезию бактерий на клеточном монослое как функция времени (0044 дин / см 2). GFP-экспрессирующих бактерии следующие направления текущей среде. Фильм ускоряется в 60 раз, реальная длительность видео составляет 10 минут. Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео. Видео 2. После начальной адгезии бактерий было позволено распространяться на клеточной поверхности в течение 7 часов (ускоренное 1000-кратное). Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео. Видео 3. После распространения на клеточной поверхности механикдр. сопротивление микроколоний была проверена путем увеличения сдвига уровня напряжения до 10 дин / см 2 в течение 5 минут, но дикие микроколоний типа устойчивы ускоренной в 60 раз. Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео. Видео 4. Микроколонии образована pilV мутант нарушается потоком увеличение (10 дин / см 2). Этот мутант не может вызвать реконструкция плазматической мембраны под микроколоний и, следовательно, более высокую чувствительность к увеличению напряжения сдвига (видео ускоряется в 60 раз) 5. Нажмите сюда, чтобы посмотреть видео.