Présentation de contrainte de cisaillement dans l'étude de l'adhésion bactérienne

1. Cellule hôte de l'homme et de la culture bactérienne HUVEC culture entre le passage 1 et 9 à 37 ° dans un incubateur humidifié avec 5% (v / v) de CO 2. Passage des cellules quand ils s'approcheront 80% de confluence avec la trypsine / EDTA à fournir des cultures de maintenance sur 75 flacons cm 2 de culture et de cultures expérimentales en chambres d'écoulement jetables (μ-Slides VI). Retirer moyenne des flacons pour être repiquées, laver les cellules avec 10 ml de PBS, de retirer et le remplacer par 1,5 ml de trypsine / EDTA. Permettre aux cellules de se détacher dans un incubateur de culture cellulaire pendant 5 minutes à 37 ° C. Recueillir les cellules avec 10 ml de milieu de culture cellulaire dans un tube de 15 ml de collecte. Pellet les cellules avec une centrifugation de 5 minutes (à 200 g), à température ambiante. Suspendre les cellules dans 4 ml d'Endo-GDF complété avec 10% (v / v) de FBS et les compter sur une chambre de Malassez, conformément aux instructions du fabricant. Présentez-30 ul d'un 1×10 6 cellules HUVEC par ml de suspension dans le canal (3×10 4 au total) et permettent aux cellules d'adhérer pendant 3 heures à 37 ° dans un incubateur humidifié avec une atmosphère de 5% (v / v) de CO 2. Ajouter un volume supplémentaire de 120 pl d'Endo-GDF pour remplir les puits. Les cellules doivent former une monocouche subconfluentes (figure 2). Cultivez N. meningitidis exprimant la GFP (dans ce cas souche 8013 GFP exprimé sous le contrôle d'un promoteur inductible par l'IPTG), sur gélose GCB contenant des suppléments de Kellogg et 5 ug / ml de chloramphénicol à 37 ° C dans une atmosphère humide contenant 5% (v / v) de CO 2 pendant 16 heures. 2. Adhérence initiale de bactéries individuelles à des cellules hôtes Ajuster la concentration de bactéries cultivées sur gélose GCB à une DO600 de 0,05 avec préchauffé Endo-GDF, contenant 10% (v / v) de FBS et incuber pendant 120 minutes à 37 ° C dans une atmosphère humide contenant 5% (v / v) de CO 2, sous agitation douce (130 rpm). Induire l'expression de la GFP en ajoutant 1 mM d'IPTG dans le milieu de culture pour la période d'incubation. Placez le jetables μ-Slide sur la scène d'un microscope inversé équipé d'une plateforme chauffé pour maintenir la température de l'échantillon à 37 ° C. Verser préchauffé Endo-GDF supplémenté avec 2% (v / v) de FBS dans un bécher de verre stérile et de remplir une seringue stérile de 50 ml avec ce médium. Fixez le "entrée" tube à la seringue et remplir par l'introduction à moyen terme. Connectez le "entrée" tuyau à la μ-Slide, avec soin, afin d'éviter l'introduction d'air dans la chambre. Puis, apposer la «sortie» du tube à l'autre extrémité et remplissez soigneusement le canal de moyenne à environ 1 cm de distance de la chambre de «sortie». Mesurer la DO600 bactérienne et d'ajuster à 0,15 en Endo-GDF contenant 2% (v / v) de FBS. Afin de regarder les bactéries individuelles, les agrégats doivent être perturbée par des vortex vigoureux de l'échantillon bactérien. Placer 100 pi d'Endo-GDF supplémenté avec 2% (v / v) de FBS milieu dans le réservoir et ajouter 100 ml de la solution bactérienne prises depuis le sommet de la solution de vortex d'éviter de prélever des autres agrégats bactériens. Soigneusement introduire le volume de 200 ul dans le μ-Slide en tournant le robinet d'injecter des bactéries dans la chambre. Présentez-Endo-GDF contenant 2% (v / v) de FBS, maintenue à 37 ° C avec la plate-forme chauffée, dans la chambre à l'aide d'une seringue avec une contrainte de cisaillement compatible avec l'adhésion de 0,044 dynes / cm 2 pendant 15 minutes. Voir par exemple la vidéo 1 ou la figure 3. Après cette étape, soit de déplacer des articles 3, 4 ou 6. 3. Quantification de l'adhésion initiale des bactéries aux cellules hôtes individuels Après l'adhésion initiale pendant 15 minutes, d'acquérir des images de dix champs au hasard tandis que le liquide est toujours en circulation. Analyser les images acquises en utilisant le logiciel ImageJ 8, afin d'accéder au nombre moyen de bactéries adherant par champ. Cela se fait comme suit: tout d'abord, chaque image est seuillée en utilisant le «seuil» dans la fenêtre de trouver menu "Image" pour mettre en évidence individuels adhérant bactéries fluorescentes, tout en minimisant le fond des cellules. Ensuite, chaque bactérie unique est compté, en utilisant le Plug-In "Contre Cell" ( http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html ). Les données pour chaque image sont rapportés dans un tableur Excel et sont en moyenne de quantifier le nombre moyen de bactéries adhérentes par champ. 4. Mesure de la résistance à l'écoulement des bactéries individuelles adhérentes à cellules de l'hôte Programme de la pompe seringue mise en place pour générer des contraintes de cisaillement variant de 3 à 100 dynes / cm 2 pendant 5 minutes. A la fin des 5 minutes, l'acquisition de dix champs choisis au hasard, comme décrit dans l'étape 3.1, mais avec l'écoulement arrêté prIOR à l'acquisition. Analyser les images acquises comme décrit dans l'étape 3.2 et de quantifier le nombre moyen de bactéries restantes par champ. 5. Mesurer la croissance d'une bactérie isolée adhérente à une micro- Présentez-Endo-GDF, contenant 10% (v / v) de FBS, maintenue à 37 ° C avec la plate-forme chauffée, dans la chambre à l'aide d'une seringue avec le stress de cisaillement choisie pour plusieurs heures. Enregistrement des images pour la microscopie vidéo en temps réel à une image toutes les 5 minutes. Suite à la microscopie vidéo, arrêtez la contrainte de cisaillement en désactivant la pompe seringue, d'acquérir des images supplémentaires 2-3 puis arrêter la séquence d'acquisition d'image sur le logiciel. Un exemple de la prolifération bactérienne peut être vu sur la vidéo 2. 6. Mesure de la résistance à l'écoulement des microcolonies bactériennes adhérente Après la formation de microcolonies grande à la surface cellulaire (step5.2) acquérir 2-3 images des deux cellules (par contraste de phase) et des bactéries (par la GFP-fluorescence) avant l'application de flux. Pour le reste de l'expérience, le protocole d'acquisition sera de surveiller que la fluorescence. Application des contraintes de cisaillement élevées pendant 5 minutes (300-100 dynes / cm 2) et d'enregistrer des images à une image toutes les 5 secondes. Arrêtez la contrainte de cisaillement en désactivant la pompe seringue, d'acquérir des images supplémentaires 2-3 puis arrêter la séquence d'acquisition d'image sur le logiciel. Ensuite, retirez la "sortie" première tubulure et soigneusement, pour éviter de vider le canal, puis ajoutez préchauffé milieu frais pour remplir les puits avant d'enlever le "entrée" tubes. Pour déterminer quantitativement l'effet de la contrainte de cisaillement sur la résistance bactérienne, un dosage de plaquage peut être effectuée comme suit: recueillir le milieu restant et laver les μ-Slide deux fois avec 120 pl de PBS, qui enlève le milieu restant du canal (deux lavages sont ) a également recueilli. Détacher les cellules infectées par l'ajout de 50 pi de trypsine / EDTA pendant 5 minutes à 37 ° et mélanger cet échantillon indépendante avec la suspension recueillis à l'étape précédente. Effectuer des dilutions en série dans du PBS et la plaque une fraction de 10 ul sur des plaques de gélose GCB, en trois exemplaires, afin de déterminer le nombre d'unités formant colonies (UFC), le jour suivant, après l'incubation des plaques à 37 ° C dans un incubateur à 5% (v / v) de CO 2. Vidéos 3 et 4 comparer la souche de type sauvage avec le mutant pilV. 7. Décollement de microcolonies bactériennes Infecter les cellules dans la chambre d'écoulement en répétant les étapes 2.1 à 2.8 et permettent l'infection se poursuivre pendant 30 minutes. Retirer bactéries non en augmentant le flux à 10 dynes / cm 2 pour une période de 2 minutes et laisser l'infection se poursuivre pendant 2h. Réduire le débit à 0,15 dynes / cm 2. Chaque heure, de recueillir une goutte de milieu sortant de la chambre d'écoulement. Effectuer des dilutions en série des échantillons et leur plaque sur gélose GCB. Déterminer le nombre d'unités formant colonies (UFC), le jour suivant, après l'incubation des plaques à 37 ° C dans un incubateur à 5% (v / v) de CO 2. 8. Les résultats représentatifs Figure 1: Différentes étapes d'une monocouche cellulaire qui peuvent être observés et mesurés en présence de l'écoulement dans la procédure. Figure 2: monocouche de cellules endothéliales dans la chambre de circulation au début d'une expérience (absence de cisaillement). Environ 50 cellules endothéliales sont organisés en une monocouche sous-confluente. Figure 3: représentation graphique de l'adhésion initiale des bactéries à la surface cellulaire. Les valeurs des trois champs sont indiqués pour donner une idée de la variation de champ à champ qui est prévu (0044 dynes / cm 2). Vidéo 1. Visualisation de l'adhésion initiale des bactéries sur la monocouche cellulaire en fonction du temps (0044 dynes / cm 2). Exprimant la GFP bactéries sont en suivant la direction du milieu coule. Le film est accéléré de 60 fois, la durée réelle de la vidéo est de 10 minutes. Cliquez ici pour voir la vidéo. Vidéo 2. Après l'adhésion initiale des bactéries ont été autorisés à proliférer à la surface cellulaire pour une période de 7 heures (accélérée 1000 fois). Cliquez ici pour voir la vidéo. Vidéo 3. Après la prolifération à la surface cellulaire le mécanicienRésistance al de microcolonies a été testé en augmentant le niveau de stress de cisaillement à 10 dynes / cm 2 pendant 5 minutes, mais microcolonies de type sauvage sont résistants accélération de 60 fois. Cliquez ici pour voir la vidéo. Microcolonies vidéo 4. Formé par le mutant pilV sont perturbés par augmenter le flux (10 dynes / cm 2). Ce mutant ne parvient pas à induire le remodelage de la membrane plasmique en microcolonies et est donc plus très sensibles à la contrainte de cisaillement augmente (la vidéo est accélérée 60 fois) 5. Cliquez ici pour voir la vidéo.