إدخال إجهاد القص في دراسة الالتصاق الجرثومي
Summary
خلال عملية العدوى ، وخطوة رئيسية هي التصاق العوامل الممرضة مع الخلايا المضيفة. في معظم الحالات يحدث التصاق هذه الخطوة في وجود إجهاد المتولدة عن تدفق السائل. نحن تصف الاسلوب الذي يقدم إجهاد القص كمعلمة مهمة في دراسة التصاق البكتيريا.
Abstract
الالتهابات البكتيرية خلال سلسلة من التفاعلات التي تحدث بين العناصر الممرضة والمضيفة لها. التصاق البكتيريا إلى المضيف سطح الخلية غالبا ما يكون خطوة أولية وتحديد للالمرضية. على الرغم من أن معظمهم درس التصاق تجريبيا في ظروف ثابتة التصاق يحدث فعلا في وجود تدفق السائل. يصادف الأول بين البكتيريا والتي تستضيفهم وغالبا ما تحدث على مستوى الغشاء المخاطي والفم والرئة والأمعاء ، والعين… الخ ، حيث تدفق المخاط على سطح الخلايا الظهارية. في وقت لاحق العدوى ، ومسببات الأمراض في بعض الأحيان وصول الدورة الدموية مما تسبب أمراض تهدد الحياة مثل تعفن الدم ، وتسمم الدم والتهاب السحايا. والسمة المميزة لهذه الالتهابات هي قدرة هذه الجراثيم على التفاعل مع الخلايا البطانية في وجود تداول الدم. وجود تدفق السائل ، المخاط أو الدم على سبيل المثال ، تحدد التصاق لأنه يولد قوة ميكانيكية على الممرض. لتوصيف تأثير تدفق السائل one عادة ما يشير إلى مفهوم إجهاد القص ، الذي هو القوة المبذولة عرضية في وحدة المساحة التي يتحرك السائل بالقرب من الجدار ثابتة ، وأعرب في dynes / سم 2. شدة إجهاد القص تختلف على نطاق واسع وفقا لنوع السفن المختلفة ، وحجم والجهاز ، والموقع الخ (0-100 dynes / سم 2). ويمكن تداولها في الشعيرات الدموية منخفضة جدا تصل إلى قيم إجهاد القص والتوقف ولو مؤقتا خلال فترات تتراوح بين بضع ثوان إلى عدة دقائق 1. يمكن على الطرف الآخر من الطيف إجهاد القص في الشرايين dynes تصل إلى 100 / سم 2 2. وقد كان تأثير إجهاد القص على العمليات البيولوجية المختلفة بوضوح كما على سبيل المثال خلال التفاعل بين الكريات البيض مع 3 البطانة. على أن تأخذ في الاعتبار هذه المعلمة الميكانيكية في عملية التصاق البكتيريا اتخذنا الاستفادة من إجراء التجارب على أساس استخدام المتاح من تدفق غرفة 4. تزرع الخلايا المضيفة في غرفة التدفق ويتم إدخال البكتيريا الفلورسنت في تدفق تسيطر عليها مضخة الحقنة. ركزنا في البداية على تحقيقاتنا النيسرية السحائية الممرض الجرثومي ، وهي بكتيريا سالبة الجرام المسؤولة عن تسمم الدم والتهاب السحايا. ووصف الإجراء سمح لنا هنا لدراسة تأثير إجهاد القص على قدرة البكتيريا على : التمسك الخلايا 1 ، لتنتشر على سطح الخلية (5) وفصل لاستعمار المواقع الجديدة 6 (الشكل 1). ويمكن الاطلاع على معلومات فنية تكميلية في اشارة 7. وقد تم اختيار قيم إجهاد القص المقدمة هنا على أساس تجربتنا السابقة (1) وتمثل القيم الموجودة في الأدب. ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق بروتوكول لطائفة واسعة من مسببات الأمراض مع تعديلات محددة تبعا لأهداف الدراسة.
Protocol
Discussion
ويتزايد الضغط على أهمية القص وعموما من الجوانب الميكانيكية في البيولوجيا يتم الاعتراف بها. على سبيل المثال تم التعرف على خصائص تكييف عالية لاصقة للأسرة Selectin من البروتينات في عملية التصاق الخلايا الليمفاوية والمتداول على جدار الأوعية الدموية عن طريق إدخال إجهاد القص في هذه العملية. تم تطبيق الإجراء المذكور أعلاه إلى السحائية سلبية الغرام النيسرية البكتيريا ولكن ينبغي أن ينطبق على طائفة واسعة من مسببات الأمراض. وقد تبين أهمية إجهاد القص أيضا لمسببات الأمراض الأخرى ومواقع عدوى أخرى. وقد وصف التصاق البكتيريا مشروطا إجهاد القص من خلال دراسة وadhesin FimH العثور على القولونية uropathogenic (UPEC) 9. وقد أبلغ مشابهة Selectins ، تبين أن التفاعل بين FimH ومستقبله الخلية المضيفة ليكون معززا القص بفعل القوى الميكانيكية (9) وadhesin CfaE من القولونية المعوي أيضا للتوسط لالتصاق الخلايا الظهارية في الأمعاء عن طريق تعتمد على القص آلية 10. وذكرت لنا ، وذلك باستخدام مقايسة غرفة التدفق الصفحي البروتوكول الموصوفة في هذا الفصل أن العقدية القاطعة للدر الشعرة كانت ضرورية لانضمام هذا الممرض إلى الخلايا الظهارية في ظل ظروف تدفق 11. مثل هذه الدراسات تؤكد أن لدينا غرفة فحص التدفق هو أداة مفيدة للتحقيق في الخلية المضيفة الممرض التفاعلات تحت ظروف إجهاد القص.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب أود أن أشكر اميلي Mairey Donnadieu وايمانويل ليصل الإعداد الأولي من هذا الإجراء.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
| μ-Slide VI0.4 flow kit | IBIDI | 80606 |
| Syringe Plastipak 50 ml Luer-Lock | Becton Dickinson | 300865 |
| Tygon Tubing R3603 3.2 x 4.8mm | Fisher-Scientific | R3603 |
| 3-way stopcock, 2 female luer to male luer | Bio-Rad | 7328103 |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | PHD 2000 |
| Inverted microscope, Nikon | Nikon | Eclipse Ti |
| CCD camera | Hamamatsu | ORCA 285 CCD or ORCA 3-CCD |
| ImageJ software | NIH | Freeware (http://rsbweb.nih.gov/ij/) |
References
- Mairey, E. Cerebral microcirculation shear stress levels determine Neisseria meningitidis attachment sites along the blood-brain barrier. J Exp Med. 203, 1939-1950 (2006).
- Pries, A. R., Secomb, T. W., Gaehtgens, P. Design Principles of Vascular Beds. Circ Res. 77, 1017-1023 (1995).
- Zarbock, A., Ley, K. Neutrophil adhesion and activation under flow. Microcirculation. 16, 31-42 (2009).
- Tissot, O., Pierres, A., Foa, C., Delaage, M., Bongrand, P. Motion of cells sedimenting on a solid surface in a laminar shear flow. Biophys J. 61, 204-215 (1992).
- Mikaty, G. Extracellular bacterial pathogen induces host cell surface reorganization to resist shear stress. PLoS Pathog. 5, e1000314-e1000314 (2009).
- Chamot-Rooke, J. Posttranslational modification of pili upon cell contact triggers N. meningitidis dissemination. Science. 331, 778-782 (2011).
- Soyer, M., Dumínil, G., Christodoulides, M. Bacterial adhesion under shear stress. Neisseria meningitidis: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology). , (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).
- Thomas, W. E., Trintchina, E., Forero, M., Vogel, V., Sokurenko, E. V. Bacterial adhesion to target cells enhanced by shear force. Cell. 109, 913-923 (2002).
- Tchesnokova, V. Shear-enhanced binding of intestinal colonization factor antigen I of enterotoxigenic Escherichia coli. Mol Microbiol. 76, 489-502 (2010).
- Konto-Ghiorghi, Y. Dual role for pilus in adherence to epithelial cells and biofilm formation in Streptococcus agalactiae. PLoS Pathog. 5, e1000422-e1000422 (2009).
