Lignocellulosic Malzemeler için Yüksek verim Saccharification Testi

1. Örneklerinin hazırlanması: Biz normalde otsu ve odunsu bitkilerin ya sapları ile çalışır. Otsu malzemelerin durumda biz olgunluk bitkiler büyümeye ve tohum oluşumu yaşlanması tamamlandıktan sonra sonra biz kuru sapları toplamak. Sapları 4 mm parça halinde doğranmış ve üç öğütme topları ile 2 ml flakon yerleştirilir. Odunsu bir malzeme söz konusu olduğunda, örneklerin bir ders ahşap dosya ile kaba talaş zemin ve daha sonra daha fazla işlem için bir bilyalı değirmen yerleştirilir. Örnekleri taşlama / istasyonu (Şekil 1) biçimlendirme içinde bir rafa yerleştirilir. Bu istasyon sırayla biler karışımları ve her bir örnek ağırlığındadır. Örnek başına gerekli tekrarlar, belirli bir parçacık boyutu için içsel değişkenlik belirlenir ön deneyler bir dizi zemin malzemesi test ederek kurulmuştur. 2 ml flakon altta deldi ve malzemeler seçilmiş iyi flakonun titreşim dağıtılmıştır. Titreşimli kol, toz doğru dağıtım için izin dengesi bir geri besleme tarafından kontrol edilir. Robot standart bir analiz / 4 mg yayar ve 4 tekrarlar durumlarda şartlarda ihtiyaç vardır. Bu 20 bitki örneklerinin / plaka analiz edilmesini sağlıyor. 2. Tedavi öncesi Numunelerin biçimlendirilmiş sonra, 96-iyi plakalar, otomatik bir sıvı taşıma sistemi (Şekil 2) tarafından işlenir. Burada hafif bir tedavi öncesi asit veya alkali çözeltiler 350 mcL ekleyerek ve uyarlanmış bir blok üzerine tabak ısıtma bitki materyali yapılır. Analizi sırasında buharlaşmasını önlemek için, 96 kuyucuğu bir silikon mat ile mühürlenir. Sıcaklığı ve süresi, tedavi öncesi çalışılan malzemeye göre değişiklik yapılabilir. Maksimum sıcaklık, ancak 100 ° C Sert ön işlemleri test etmek için alternatif bir prosedür, çizgi dışı malzemeler ön işlemden ve pretreatmet süreci ortadan kaldırmak için. 3. Hidroliz Malzemelerin ön tedavi edildikten sonra, robot, tedavi öncesi çözüm ve yıkar, tüm kuyuları, 5 kez 850 mcL 25 mM Asetat Tamponu otomatik olarak kaldırır. Çalkalama, tedavi öncesi bir çözüm tampon ekleyerek ve daha sonra örnek katıların yerleşmelerine izin verme sonra toplam hacminin% 50 kaldırarak tarafından yürütülmektedir. Aspirasyon yüksekliği iyi alt katıların aspire önlemek için sıvı kütlesinin yarısı; bu yaklaşımı kullanarak katıların ihmal kaybı. Bu yıkar sonra iyi pH 4.5 ve malzeme enzimatik hidroliz için hazırdır. Sellülazlar ve hemicellulases bir çözüm içeren bir enzim karışımı robot tarafından eklenir. Her kuyuya, 850 mcL enzim karışımı sürülür ve 50 ° C sallayarak inkübatör plaka taşınır. Standart hidroliz 8 saat için yapılır, ama bu sefer Deneyin amacı adapte edilebilir. Otlar için kullanılan standart bir enzim yükleme malzeme 7 FPU / g. 4. Indirgen şeker tespiti Hidroliz sonra yayımlanan indirgen şeker tayini, modifiye edilmiş bir 3-metil-2-benzothiazolinone hydrozone (MTBH) yöntemi 3 kullanılarak gerçekleştirildi . Otomatikleştirmek için en kolay ve protein gibi bileşikler girişime en az hassas olması nedeniyle MBTH en uygun yöntem olarak seçilmiştir. , Doğru, biyokütle hidrolizatların konsantrasyonlarında şekerler ölçmek öyle ki, Biz standart bir optik 96 plaka için uygundur 250 mcL nihai hacmi ile robot platformu kullanmak için bu son derece duyarlı bir yöntem değiştirdi. Altındaki tüm adımları otomatik olarak yapılır ve her saccharification reaksiyon için indirgen şekerler üç bağımsız tespitler yapılmıştır. Hidrolizat 30 mcL derin kuyu plaka alınan ve 25 mM Sodyum Asetat tampon etekli PCR 96 plaka 45 mcL ile karıştırılır. (25) 1N NaOH mcL ve 0.43 mg / ml MBTH ve 0.14 mg / ml DTT içeren bir çözüm 50 ul eklendi. Karıştırıldıktan sonra, PCR plaka 60 ısıtılmış ° C 20 dakika 96 kuyulara tam olarak aynı miktarda ısı sağlayan bir PCR veya benzeri bir cihaz. Ortaya çıkan reaksiyon optik plaka transfer edildi. Oksitleyici reaktif (% 0.2 FeNH4 (SO4) 2,% 0.2 SÜLFAMİK asit ve% 0.1 HCI) 100 ul ekleyin. En az 1 saat süreyle iyice karıştırınız ve geliştirmek için bırakın Her plakası da 50 nmol, 100 nmol ve 150 nmol glukoz standart reaksiyonlar içermelidir. Optik plakaları 620 nm'de okunur. 5. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 3 ve 4 farklı türde analiz örnekleri sunulmaktadır. Otomatik platformu kullanarak tüm sonuçlar elde edildi. Şekil 3 tekrarselülolitik enzimlerin artan miktarlarda toprak kavak 8 saat inkubasyon tarafından yayımlanan indirgen şeker artış sunar. Şekil 4, asit ve alkali tedavi öncesi kavak numuneler üzerinde etkileri sunar. NaOH ön arıtma daha verimli olduğunu hidrolizi sırasında serbest bırakılması şekerler kolaylaştırmada seyreltilmiş H2SO4 tedavi öncesi. Hidroliz sonra ölçülen şekerlerin miktarı, tedavi öncesi 1M daha yüksek NaOH konsantrasyonları kullanılarak yapıldığında azalır. Şekil 1 öğütme ve biyokütle 96 iyi biçimlendirme Robotik istasyonu Şekil 2: Yüksek Verim saccharification analizi için sıvı taşıma istasyonu Şekil 3 kavak örnekleri şeker benzerleri azaltarak serbest bırakılması farklı bir enzim yükleri Etkisi NaOH ön işlemleri aynı sıcaklıkta ve saatte asit ön arıtma daha sonra serbest H2SO4 farklı yüzdeler ile Pretreament 90 ° C de 30 dakika sonra serbest Şekil 4 saccharification kavak örneklerinin farklı ön işlemleri Etkisi A. Şeker B. Şeker .