Высокая пропускная способность осахаривания Пробирной для лигноцеллюлозной материалы

1. Подготовка образцов Мы обычно работаем со стеблями, либо из травянистых или древесных растений. В случае травянистых материалов мы выращиваем растения до погашения, а после развития семян, которую мы собираем сухие стебли раз старения является полным. Стебли нарезанные на 4 сегмента мм и помещен в 2 мл флаконах с тремя шарами фрезерования. В случае древесных материалов, образцы измельчают до грубого опилки с файлом дрова и затем помещается в шаровой мельнице для дальнейшей обработки. Образцы помещают в стойку внутри шлифования / форматирование станции (рис. 1). Эта станция последовательно измельчает, смешивает, а вес каждого образца. Количество повторений необходимо на один образец устанавливается испытание измельченного материала в серии предварительных экспериментов, где внутренняя изменчивость определенного размера частицы определяется. 2 мл флаконы пронизаны на дне и материалы выдаются на вибрацию флакона по выбранному хорошо. Вибрирующей руке находится под контролем обратной связи от баланса позволяет точное дозирование порошка. Робот распределяет 4 мг / лунку в стандартный анализ и 4 повторений необходимы в большинстве случаев. Это позволяет 20 образцы растений / пластины для анализа. 2. Предварительная обработка Как только образцы отформатирован, 96-луночных обрабатывается автоматизированной системой обработки жидкости (рис. 2). Здесь мягкий предварительная обработка производится на растительных материалов путем добавления 350 мкл кислоты или щелочи и нагревания пластины на адаптированы блока. Чтобы избежать испарения при анализе 96-луночных уплотнены силиконовым матовым. Температуры и времени предварительной обработки может быть изменена в соответствии с материалами изучается. Максимальная температура, однако, составляет 100 ° C. Альтернативная процедура для тестирования жестких предварительной обработки является для предварительной обработки материалов в автономном режиме и устранения pretreatmet от процесса. 3. Гидролиз После предварительной обработке материалов, робот автоматически удаляет предварительной обработки решение, и моет, все колодцы, 5 раз с 850 мкл 25 мМ ацетатного буфера. Полоскания осуществляется путем добавления буфера для предварительной обработки решение, а затем удаление 50% от общего объема после учета твердых частиц в образце, чтобы обосноваться. Высота стремление устанавливается на половине массы жидкости, чтобы избежать аспирации твердых частиц от дна ямы, есть незначительная потеря твердых тел с помощью этого подхода. После этих моет рН в скважине составляет 4,5 и материал будет готов для ферментативного гидролиза. Фермент смеси, содержащей решение целлюлазы и hemicellulases добавляется робота. В каждую лунку, 850 мкл фермента смесь разливают и пластина перемещается в 50 ° C пожимая инкубатора. Стандартный гидролиза проводят в течение 8 часов, но на этот раз может быть адаптирована к цели эксперимента. Стандартные загрузки фермент используется для трав составляет 7 FPU / г материала. 4. Определение редуцирующих сахаров Определение редуцирующих сахаров освобожден после гидролиза проводили с использованием модифицированной 3-метил-2-benzothiazolinone hydrozone (MTBH) метод 3. MBTH был выбран как наиболее подходящий метод, потому что это был самый легкий для автоматизации и наименее чувствительны к помехам от соединения, такие как белки. Мы изменили это очень чувствительный метод для использования на платформе робота, чтобы он мог точно количественно сахара в концентрациях присутствует в биомассе гидролизатов, в конечном объеме 250 мкл, которая пригодна для стандартных оптических 96 ячейках. Все действия выполняются автоматически и три независимых определения редуцирующих сахаров проводились для каждой осахаривания реакции. 30 мкл гидролизата было взято из глубокого колодца пластины и смешивают с 45 мкл 25 мМ буферного раствора ацетата натрия в обогнул ПЦР 96-луночного планшета. 25 мкл 1 н NaOH и 50 мкл раствора, содержащего 0,43 мг / мл MBTH и 0,14 мг / мл DTT были добавлены. После смешивания пластины ПЦР нагревали при 60 ° С в течение 20 мин в амплификаторе или аналогичного устройства, которое обеспечивает именно такое же количество тепла, чтобы все 96 лунок. Полученную реакционную был переведен в оптическом пластины. Добавить 100 мкл окислительного реагента (0,2% FeNH4 (SO4) 2, 0,2% сульфаминовой кислоты и 0,1% HCl). Хорошо перемешать и оставить развиваться, по крайней мере, 1 ч. Каждая пластина должна также содержать стандартных реакций из 50 нмоль, 100 и 150 нмоль нмоль глюкозы. Оптические пластины читаются при 620 нм. 5. Представитель Результаты: Примеры различных видов анализа представлены на рисунке 3 и 4. Все результаты были получены с помощью автоматизированной платформы. Рисунок 3 повторнопредставляет увеличения редуцирующих сахаров выпущен на 8 ч инкубации с земли тополя с увеличением количества целлюлолитических ферментов. На рисунке 4 представлена ​​последствий кислых и щелочных предварительной обработки на тополь образцов. Предварительная обработка NaOH является более эффективным, что разбавленный H2SO4 предварительной обработки для облегчения выпуска сахара в процессе гидролиза. Количество сахара измеряется после гидролиза уменьшается при предварительной обработке осуществляется с помощью NaOH концентрациях выше 1М. Рисунок 1. Роботизированная станция для шлифования и 96 также форматирование биомассы Рисунок 2. Жидкие станции обработки для анализа Высокая пропускная осахаривания Рисунок 3. Влияние различных нагрузках фермента об освобождении снижения сахара эквивалентов от тополя образцы Рисунок 4. Влияние различных предварительной обработки на осахаривания тополя образцов. А. Сахаров освобожден после pretreament с различными процент H2SO4 при 90 ° С в течение 30 минут. Б. Сахаров освобожден после предварительной обработки NaOH при той же температуре и времени, чем кислоты предварительной обработки .