De alto rendimiento de sacarificación de ensayo para materiales lignocelulósicos

1. Preparación de las muestras Normalmente trabajo con tallos herbáceos o de cualquiera de las plantas leñosas. En el caso de las materias herbáceas que crecen las plantas a la madurez, y después de desarrollo de la semilla que obtenemos los tallos secos, una vez se haya completado la senescencia. Los tallos se cortan en segmentos de 4 mm y se colocan en viales de 2 ml con tres bolas de molienda. En el caso de materiales leñosos, las muestras se muelen a grueso aserrín de madera con un archivo de curso y se coloca en un molino de bolas para su posterior procesamiento. Las muestras se colocan en un estante en la molienda / formato de la estación (Figura 1). Esta estación forma secuencial muele, se mezcla, y un peso de cada muestra. El número de repeticiones necesarias para cada muestra se estableció mediante pruebas de los materiales del suelo en una serie de experimentos preliminares en donde se determina la variabilidad intrínseca de un tamaño de partícula determinado. Los viales de 2 ml se perforan en la parte inferior y los materiales son distribuidos por la vibración de la ampolla en el pozo seleccionado. El brazo de vibración es controlada por una retroalimentación del equilibrio que permite la dosificación precisa de la pólvora. El robot dispensa 4 mg / pocillo en un análisis estándar y 4 repeticiones son necesarias en la mayoría de los casos. Esto permite que 20 muestras de plantas / placa para ser analizados. 2. Pretratamiento Una vez que las muestras tienen el formato, las placas de 96 pozos son procesadas por un sistema automatizado de manejo de líquidos (Figura 2). Aquí un pretratamiento suave se realiza en los materiales vegetales mediante la adición de 350 l de soluciones ácidas o alcalinas y el calentamiento de la placa en un edificio adaptado. Para evitar la evaporación durante el análisis, el 96 y placas se sellan con un mate de silicona. La temperatura y el tiempo de la pre-tratamiento se puede modificar de acuerdo a los materiales objeto de estudio. La temperatura máxima, sin embargo, es de 100 ° C. Un procedimiento alternativo para la prueba más dura pretratamientos es dar tratamiento previo a los materiales fuera de línea y eliminar la pretreatmet del proceso. 3. Hidrólisis Después de que los materiales son tratados previamente, el robot elimina automáticamente la solución pre-tratamiento, y se lava, todos los pozos, 5 veces con 850 l de tampón acetato 25 mM. Los enjuagues se llevan a cabo mediante la adición de tampón de la solución pre-tratamiento, y posteriormente retirar el 50% del volumen total después de permitir que los sólidos en la muestra a un acuerdo. La altura de la aspiración es igual a la mitad de la masa líquida para evitar la aspiración de sólidos desde el fondo del pozo, hay una pérdida insignificante de los sólidos utilizando este enfoque. Después de estas soluciones el pH en el pozo es de 4,5 y el material está listo para la hidrólisis enzimática. Una mezcla de enzimas que contienen una solución de celulasas y hemicelulasas se añade por el robot. En cada pozo, 850 l de mezcla de enzimas se dispensa y la placa se mueve en un 50 ° C incubadora de agitación. La hidrólisis se lleva a cabo estándar de 8 horas, pero esta vez se puede adaptar a la finalidad del experimento. La carga de la enzima estándar utilizado para los pastos es de 7 FPU / g de material. 4. La detección de azúcares reductores Determinación de azúcares reductores liberados después de la hidrólisis se realizó mediante una modificación de 3-metil-2-benzotiazolinona hidrozona (MTBH) el método 3. MBTH fue seleccionado como el método más adecuado, porque era el más fácil de automatizar y el menos susceptible a la interferencia de estos compuestos como las proteínas. Hemos modificado este método altamente sensible para su uso en la plataforma robótica para que pueda cuantificar con precisión los azúcares en las concentraciones presentes en los hidrolizados de biomasa, con un volumen final de 250 l, que es adecuado para un nivel óptico de 96 pocillos. Todos los pasos se realizan automáticamente y tres determinaciones independientes de los azúcares reductores se llevaron a cabo para cada reacción de sacarificación. 30 l de hidrolizado fue tomada de la placa de pozo profundo y se mezcla con 45 l de 25 mM de tampón acetato de sodio en una falda PCR 96 pocillos. 25 l de NaOH 1N y 50 l de una solución que contiene 0,43 mg / ml y 0,14 MBTH TDT mg / mL. Después de mezclar, la placa de PCR se calentó a 60 ° C durante 20 minutos en un termociclador o un dispositivo similar que ofrece exactamente la misma cantidad de calor para los 96 pozos. La reacción resultante se transfirió a una placa óptica. Añadir 100 ml de reactivo oxidante (0,2% FeNH4 (SO4) 2, 0,2% de ácido sulfámico y el 0,1% HCl). Mezclar bien y dejar a desarrollar por lo menos durante 1 h. Cada plato debe contener también las reacciones estándar de 50 nmol, 100 y 150 nmol glucosa nmol. Las placas se leen óptica a 620 nm. 5. Los resultados representativos: Ejemplos de diferentes tipos de análisis se presentan en la figura 3 y 4. Todos los resultados se obtuvieron mediante el uso de la plataforma automatizada. Figura 3 representa el aumento de los azúcares reductores liberados por 8 h incubaciones de álamo suelo con cantidades crecientes de enzimas celulolíticas. La Figura 4 muestra los efectos del ácido alcalino y pretratamiento de las muestras de álamo. El pretratamiento con NaOH es más eficiente que el pretratamiento con H2SO4 diluido para facilitar la liberación de los azúcares en la hidrólisis. La cantidad de azúcares medidos después de la hidrólisis disminuye cuando el tratamiento previo se realiza con concentraciones superiores a 1M NaOH. Figura 1. Robótico de la Estación para la molienda y el 96 y el formato de la biomasa Figura 2. Estación de manejo de líquidos para el análisis de rendimiento de sacarificación de alta Figura 3. Efecto de las cargas de enzimas diferentes en el lanzamiento de la reducción equivalente de azúcar a partir de muestras de álamo Figura 4. Efecto de pretratamientos diferentes en la sacarificación de las muestras de álamo. Azúcares A. en libertad después de pretreament con diferentes porcentajes de H2SO4 a 90 ° C durante 30 minutos. B. Azúcares en libertad después de pretratamientos de NaOH a la misma temperatura y el tiempo que el pretratamiento con ácido .