الإنتاجية العالية للمواد الفحص تسكر Lignocellulosic
Summary
يوصف بسيطة ، طريقة سريعة لتحديد إمكانية تسكر أعداد كبيرة من عينات الكتلة الحيوية النباتية. النظام الأساسي لهذا التحليل الآلي ينطوي على إعداد الكتلة الحيوية النباتية للتحليل في 96 لوحات جيدة وأداء لاحقة من التحلل ، المعالجة وتقدير من السكريات الافراج عنهم.
Abstract
ويمكن تقسيم السكريات التي تشكل الكتلة الحيوية النباتية lignocellulosic وصولا الى انتاج مجموعة من السكريات التي يمكن استخدامها لاحقا في إنشاء معامل تكرير أحيائية. وهذه الخامات تشكل منصة الصناعية الجديدة ، وهما أمران غير المستدامة ومحايدة الكربون ، لتحل محل الاعتماد الحالي على الوقود الأحفوري. تنتج تمردات لتفكيك المواد التي لوحظت في الخصائص الذاتية التي lignocellulosic العديد من جدران الخلايا النباتية. السليلوز البلورية مضمن في مصفوفة مثل السكريات وxylans arabinoxylans ، والهيكل كله المغطى من قبل الفينولية البوليمر اللجنين ، وهذا هو أيضا صعبة الهضم 1. من أجل تحسين هضم المواد النباتية نحن بحاجة لاكتشاف الاختناقات الرئيسية لتسكر من جدران الخلايا ومتحولة أيضا شاشة تربية والسكان لتقييم التغير في تسكر 2. هذه المهام تتطلب نهجا إنتاجية عالية ، وهنا نقدم منصة التحليلية التي يمكن القيام بتحليل التسكير في شكل لوحة 96 – جيدا. وقد تم تطوير هذا النظام الأساسي للسماح للفحص هضم lignocellulose أعداد كبيرة من السكان من الأنواع النباتية المختلفة. وقلصت نحن باستمرار حجم رد فعل لمعالجة مسبقة لطيف ، الإنزيمية جزئية والتصميم والسكر ، والسماح لأعداد كبيرة بسرعة المقررة في النظام الآلي.
هذا البرنامج يعمل آليا مع كميات مليغرام من الكتلة الحيوية ، وأداء طحن الكرة في ظل ظروف خاضعة للرقابة للحد من المواد النباتية إلى حجم الجسيمات بطريقة موحدة استنساخه. مرة واحدة على عينات من الأرض ، والروبوت الآلي التنسيق يوزع كميات محددة من المواد وسجلت في المقابل من الآبار بئر عميقة لوحة 96 (الشكل 1). عادة ، ونحن الاستغناء عن نفس المادة الى 4 آبار لدينا 4 يعيد للتحليل. مرة واحدة تملأ اللوحات مع المواد النباتية في التخطيط المطلوب ، يتم نقل يدويا لأنها محطة معالجة السائل (الشكل 2). في هذه المحطة التي يتعرض لها عينات إلى المعالجة إما خفيفة مع حمض مخفف أو القلوية وحضنت في درجة حرارة تصل إلى 90 درجة مئوية. بعد ذلك تتم إزالة الحل المعالجة وتشطف العينات مع عازلة لإعادتهم إلى درجة الحموضة مناسبة للالمائي. ثم يتم تحضين العينات مع مزيج الانزيم لفترة من الزمن المتغير عند 50 درجة مئوية. يؤخذ على قسامة من حلامة تلقائيا ، ونحن مصممون على خفض السكريات الأسلوب MBTH اللونية.
Protocol
Discussion
Variations of the standard saccharification protocol can be used in the same platform for determining the activity of cellulolytic enzymes (i.e. by variation of the enzyme concentrations used in a plate as well as using paper as substrate); comparison of the efficiency of several enzyme mixtures on a specific material; time course for saccharification; etc.
A standard saccharification protocol to compare the saccharification potential in different plant materials involves an eight hour hydrolysis (Figures 3 and 4). Most of the plant materials analysed requires four replicates. Under these conditions, the platform can process 80 samples/day. This analysis is being used to screen large populations of barley, maize, and brachypodium in order to establish variability in saccharification potential and the genes involved in its determination4.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
فإن الكتاب وأود أن أشكر Viksø نيلسن (Novozymes) للهدية من الانزيمات cellulolytic. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل FP7 التجديد والمشاريع التي BBSRC BB/G016178 وBB/G016194.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number |
|---|---|---|
| Grinding & weighing robot | Labman Automation | |
| 2 ml micro tube with caps | Sarstedt Ltd | 72.694 |
| 5 mm stainless steel beads | Qiagen Ltd | 69989 |
| 1.2ml Abgene square well storage plates | Fisher Scientific Ltd | TUL-050-050C |
| Whatman cap mat for 96 square well plates | Fisher Scientific Ltd | 7704-0104 |
| Liquid hanling robot | Tecan Group Ltd. | Freedom Evo 200 |
| Sulphuric acid | Fisher Scientific Ltd | S/9231/PB17 |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific Ltd | BPE359-500 |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750-500G |
| Acetic acid | Fisher Scientific Ltd | A/0420/PB17 |
| Novozyme 188 | Novozyme | DCN00214 |
| Celluclast 1.5L | Novozyme | CCN03122 |
| 96 well PCR full skirt plates | Sarstedt Ltd | 72.1980.202 |
| D-Glucose | Fisher Scientific Ltd | G/0450/53 |
| 3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | 129739-25G |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9163-1G |
| Corning microplate 96 well flat bottom | Fisher Scientific Ltd | TKT-521-050H |
| Ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate | Sigma-Aldrich | F1668-250G |
| Sulfamic acid | Sigma-Aldrich | 242772-500G |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific Ltd | 12462-0026 |
References
- Carpita, N. C. Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).
- Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing’s on the walls. New Phytol. 178, 473-485 (2008).
- Anthon, G. E., Barrett, D. M. Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone. Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).
- Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials. Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).
