Organotipik Kültürleri nöronal Çığ Çok elektrot Dizi Kayıtlar

1. Uzun vadeli Kayıtlar için MEA ile Steril, Mühürlenebilir Cam Odası Güvenli ve sıkı bir kültür odası kapatılması için gerekli olan Teflon-plastik kap (as Cam), dişli Cam silindir alt parçacığı (Şekil 1A, B) (Aceglass) yaklaşık 2 mm kesilir. Su (3x) ve 200 kanıtı etil alkol içinde 5 dakika boyunca kaynar ile durulama Temizlik cam yüzük, kurumasını bekleyin. Kısım silikon çözümü MEA yüzey cam yüzük takmak için gereklidir. 15 ml parçaları karıştırın Sylgard 184 Silikon Elastomer Kit A & B iyice -20 ° C'de 1 ml alikotları mağazası, hava kabarcıklarını çıkarmak için 15 dakika bekletin MEA Tutkal cam halka (8×8 ızgara w / iç zemin elektrot, sıçan / fare için 30 mikron elektrot çapı 200/100 mikron elektrot arası mesafe) (Şekil 1A, B). 1 ml (23 ° C) silikon küçük iğne şırınga alın. ~ 60 ° C sıcak plaka üzerinde cilasız kesme cam yüzük, merkezi cam yüzük, MEA üzerinde güçlü bir mühür yüzük dışında etrafında ek bir silikon bir tabaka halinde yüzeye silikon uygulayın, 1 – 2 saat tedavi sağlar. 3x% 70 alkol ile takip deiyonize su ile durulayın bir laminer akış kaputu MEA odası ve kamara kapaklarını sterilize edin (3 x; son alkol içinde 10 dakika bekletin durulayın) UV ışığı odanın 10 dakika maruz kalma ve kapak iç takip . Otoklav MEA odası (120 ° C; ıslak, 45 dakika) ve kurumaya bırakın. Poli-D-lizin Coat MEA ile yüzey kültür odası içinde. Oldukça lipofilik yeni ÇÇA, elektrot ızgara çözüm tekrarlanan damlacık aspirasyon ile kaplamak. Kullanılan ÇÇA için çözümü ile odasının alt kapağı, aşırı sıvı aspire, laminer kaput içinde steril koşullar altında buharlaştırmak için izin verir. MEA kamara mühür depolama ve ileride kullanmak için kapağı takın. 2. Organotipik Kültürler Hazırlanması ve Büyüme İçin Gerekli Malzemeler Steril petri (Falcon, 100 x15 ~ 5 mm seviyesinde) içine dökün,% 0.9 NaCl içinde steril agar eritin, soğumaya bırakın ve depolama için Parafilm ile steril sargı. Katı agar kullanmak için 20 x 10 x 5 mm blokları kesin. Paketleme ile saklayın süper yapıştırıcı, örneğin Devcon Super Glue II, sterilite korumak için laminer akış kaputu içinde, önce% 70 EtOH sildi. % 50 D-Glukoz (SIGMA ultra, G7528), 40 gr glikoz 40 ml deiyonize kültür su (Sigma) ekleyerek hazırlayın. -20 ° C'de 2 ml alikotları saklayın 4 ml% 50 D-glukoz 500 ml Gey Dengeli Tuz çözüm ekleyin ve kullanmadan önce dondurucuda slush (sıvı / buz kristallerinin karışımı) soğuk. Yavaşça 10 dakika, girdap ve steril bir Petri kabı içine açık içerik decantate – 5 ml de-iyonize kültür su (kabarcıklarının oluşumunu önlemek, nazik sallamak) sulandırın tavuk plazma, çözüm 5 razı sağlar. Steril filtre (0.22 mikron gözenek filtresi; protein) -20 ° C'de plazma çözüm cryotubes içine kısım 350 ul (NuncTM), mağaza (NuncTM) kısım 40 ul cryotubes içine, (0.22 mikron gözenek filtre) buna göre, steril filtre sığır plazma sulandırın trombin, -20 ° C'de saklayın Çalışan bir çözüm için, Gey dengeli tuz solüsyonu w / D-Glikoz 375 ul trombin solüsyonunun 40 ul sulandırmak. At serumu, 200 ml Bazal Orta Kartal, 4 ml% 50 glikoz ve 200 mM L-glutamin 2 ml eklenir 100 ml Hank Tamponlanmış Tuzlu Çözüm 100 ml karıştırılarak 400 ml kültür ortamı hazırlayın. 8 hafta, 100 ml'lik PYREX şişeler içinde 4 ° C – 4 saklanabilir Mitoz inhibitörü 0.3 mM üridin, 0.3 mM ARA-C sitozin-β-D-arabinofuranoside ve 0.3 mM 5-floro-2'-dezoksiuridin, steril filtre, kısım 200 ul ve -20 ° C'de 6 mağaza karışımı hazırlayın – 12 ay. 3. Korteks ve ventral tegmental alan (VTA) Doku Diseksiyon (süre: <1hr) Prosedür verim korteks ve VTA ~ 12 sıçanlar ve fareler co-kültürler ve steril koşullar altında bir laminer akış kaputu içinde hazırlanan doku kesitlerinde. Doku toplanması için toplam süresi 1 saat daha edilmelidir. 1 – 2 postnatal gün (PND), sağlıklı, iyi beslenen yavrular (abdominal 'süt nokta' varlığı çöp boyutu ~ 10) alın. Burnu ile hafifçe bir yavru tutun, özgürce asmak için izin ve hızlı bir şekilde, keskin bir makas ile boyun üssünde başını kesmek. Beyin çıkarılması için, (iki yan makas keser) cilt kaldırmak ince göz makas (1 sagital orta hat kesme, 1 koronal korteks kes / serebellum kavşağı) ile açık kafatası kesmek. 4 kafatası flep geri çevirin. Bilenmiş bir spatula yardımı ile beyin, kaudal altında, koku ampul aracılığıyla cepheden önceden spatula kesmek. Kafatası beyin yavaşça kaldırın ve hızlı soğutma ve geçici depolama için steril, soğutulmuş, Gey çözümü slayt sağlar. 2 beyinleri için daha fazla 3.2 – 3.3 adımları tekrarlayın (toplam süresi: <20 dk). VTA almak içindoku, beyinlerinin küçük bir spatula kullanarak, kuru steril bir Petri kabı üzerine aktarın. Ayrıca yaklaşık 1 cm yanlara doğru hafifçe kaydırarak her bir beyin tarafından aşırı sıvı çıkarın. Beyin sapı, beyincik düzeyinde bir jilet kullanarak koronal, dikey kesim tarafından çıkarın. Dilimleme işlemi sırasında beyin mekanik stabilizasyon için disk montaj Tutkal agar bloğu. Superglue ince bir çizgi yerleştirin disk üzerinde agar bloğu önünde birkaç milimetre (agar tutkal dokunmaktan kaçının). Küçük bir spatula kullanarak, aşağı, frontal kutup aktarmak ve her beyin monte. Frontal kutuplu montaj disk yapıştırılmış olduğunu ve ventral taraf sırasında kesilmiş dilimleri kesme ve kolay asansör-off uygun mekanik stabilizasyon elde etmek için herhangi bir tutkal kalıntı bırakmadan agar temas ettiğinden emin olun Daldırın ve güvenli montaj diski bir vibratome tepsiye beyin montaj (örneğin Leica VT1000) dikkatlice steril, soğuk Gey çözümü ile dolu. Dikkatli bir şekilde temizlenmiş bir tıraş bıçağı ile (% 90 EtOH), en yüksek titreşim frekansı Ortabeyin koronal dilim kesilmiş ve nispeten düşük 400 500 mikron kalınlığında ileri hız. Emme ampul ters bir Pasteur pipeti kullanarak, transfer ve steril, soğuk Gey çözümü ile dolu 35 x 10 mm Petri kapları VTA içeren dilim toplamak (Şekil 1C; koronal plaka 18 – 15 E22 20). Korteks bölümleri için adımları tekrarlayın 3,2 – 3,6, ancak korteks ve serebellum arasındaki dikey kesme uygulamak ve frontal kutuplu forebrains kadar montaj. Striatum düzeyinde başlayarak yaklaşık 3 koronal dilim (350 mikron kalınlığında) gelecekteki korteks diseksiyon için toplanır. Kırık Jilet yapılan bir mikro-bıçak kullanarak, VTA (Şekil 1C) içeren bir stereomikroskop altında frontal korteks ve orta beyin alanları ~ 2 mm genişliğinde koronal bölümünde teşrih. Soğutulmuş Gey çözümü ile dolu küçük yemekler (örneğin odasının slaytlar) doku bölümleri ayrı ayrı toplayın. 4. Korteks ve VTA Doku Dilimleri Montaj MEA (Saat: <1 saat) Odak elektrot dizisi ile bir stereo mikroskop altında oda sıcaklığında pozisyon MEA. Merkezi temiz, tozsuz, 25 plazma ul damlacık ve steril elektrot dizi matris. Küçük spatulae kullanarak, plazma damlacık içine dikkatlice korteks ve VTA bölümüne kaydırın. MEA soğutma plakası üzerinde yerleştirin, görüntülemek ~ 15 s için izin soğuk plazma damlacık içine trombin 25 ul eklemek, sonra tekrar odaklayın. Trombin pipet kullanarak, MEA boyunca küçük dairesel hareketler ile plazma / trombin karışımı dikkatli bir şekilde yayılır. Kırılgan elektrot dizisi doğrudan temas etmeyin. Korteks, dizinin ikinci elektrot satır boyunca dorsal sınır dizi yavaşça yerleştirin. Bu şekilde, gelişmekte olan yüzeysel katmanları sonunda dizinin hatırlatma kapsayacaktır. VTA korteks bölümü (Şekil 1D), ventral sınır komşu yerleştirilir. Cap ve gevşek MEA / kültür montaj Plazma / trombin koagülasyon için izin kaputun içinde ~ 5 dakika boyunca oda sıcaklığında oturur yüksek nemi korumak için MEA odasına yakın. 3 kültürler için daha fazla 4.3 – Bu arada, 4.1 adımı tekrarlayın. 25 x 5 / 8 iğne ile 1 cc şırınga kullanarak kültür odasına küçük damlacıklar 600 ul kültür ortamı dikkatlice ekleyin. Sıkıca MEA odası ve yerde MEA / inkübatör (Şekil 1B) içinde sallanan depolama tepsisi kültür montaj kapatın. Için, 3 prosedürü hızlandırmak – 4 ÇÇA örtüşen dizileri monte edilebilir. Montaj süresi 12 ÇÇA <1hr olmalıdır. In vitro (DIV) 2 gün sonra, 10 ul mitoz inhibitörü ekleyin. Yenile kültür ortamı 4 SAYI az% 60 ve bundan sonra her 4 günde. 5. Elektrofizyolojik Kayıt ve Uyarıcı Üretimi MEA, her elektrot için 24 kHz ~ 10 dakika ~ 1 hafta 5,6 kayıt spontan aktivite sonra yerel alan potansiyeli (LFP) ve aksiyon potansiyelleri yangın nöron eğilimi önemli deplasmanlar arasındaki ilişki kurmak için (Donanım : MEA1060 w / kararma devre, x1200 kazanç, 12 bit A / D, aralık 0-4096 mV, Çok Kanallı Sistemleri Yazılım: MC_Rack). Zemin iç toprak elektrot yoluyla sağlanan, ya da dışarıdan bir Ag / AgCl yarım hücre ekleyerek. Ekstrasellüler başak aktivite (bant geçiren 300 – 200 Hz – 3.000 Hz) 1 bir bant geçiren filtre ile LFP ayırın. Spike aktivite daha off-line başak dizicili (örneğin Plexon A.Ş.) kullanarak tek ve çoklu ünite aktivitesi ayrılabilir. Hesapla başak her elektrot için ortalamaları tetikledi. Korteks kültürler için, ortalamalarının en çok tercih edilen kültür nöronal spike zaman olarak negatif LFP deplasmanlar (nLFP) belirleyecektir. (Şekil 2) -3 standart sapma (SD) LFP izleri gürültü her elektrot için bir eşik hesaplayınNLFPs pik süreleri ve genlikleri belirlemek çapraz eşiği (Şekil 2B, C). Ayrıntılar için: 2,4 görmek için; ve süresini ¨ t ardışık zaman aktif sanat (Şekil 2D aynı olan tüm elektrottan nLFPs birleştirerek dizi Spatiotemporal nLFP kümeleri tespit bir kez bin ¨ t (2 ila 8 ms ) seçti , 5). Nöronal çığ belirlemek için, her nLFP küme boyutunu hesaplamak, örneğin sayıda aktif elektrotlar veya nLFP amplitüdleri toplamı, bir boyut histogram oluşturmak ve çift-logaritmik koordinatlarda arsa. Nöronal çığ için, boyut dağılımı, düz bir çizgi ile çift logaritmik koordinatları 2 (Şekil 2E, F) yakınlaştıkları bir güç hukuk izler . Güç yasalar istatistiksel testler için 16 Bkz. Genlik G akım kontrollü uyaranlar (Stimulus jeneratör STG 1008, Çok Kanallı Sistemler) uygulanır bir elektrot seçerek doku uyarılmış tepkiler. – 200 uA genlik-S 50 μs genlik + S / 2 ve S ile 10 arasında 100 s: elektrot zararı azaltmak için, sınırlı bir dizi bipolar kare dalga ile tek şokların şarj nötr stimülasyon kullanabilirsiniz. Daha fazla bilgi için kullanım kılavuzu bakın. Dinamik aralık 9 stimülasyon sonra 500 ms sonra tüm elektrotlar 4 kHz örnekleme hızında LFP yanıtları kaydedildi kayıt uyaran kaydetmek için. Uyaran eserler azaltmak ve pre-amplifikatör doygunluğunu önlemek için uyarılması sırasında baş sahne yükselticiler keser devresi (Multi-kanal sistemleri) kararma kullanın. 6. Temsilcisi Sonuçlar: Yeni ÇÇA ile yaklaşık 8 – 9 – 10 kültürlerin birçok hafta boyunca ayakta kalacak. Uzun vadeli kayıtların çoğu bize birçok haftalık kurs 5 üzerinden bireysel kültürlerin gelişimini takip etmek sağlayan kültür ortamı, kuvöz içinde yer alır. Deneyler dayanarak, LFP kayıtları güvenilir 100'den fazla kültür günü için kullanılan ÇÇA ile elde edilebilir. Buna karşılık, ekstrasellüler başak aktivitesi daha güvenilir nispeten yeni ÇÇA (<40 kültür gün) ile ölçülür. Tipik bir deneyde, kültür odası mühürlü tutmak bağlı baş evre (Şekil 1B, sol) ile tepsiye depolama tepsisi (Şekil 1B, sağ) bir MEA aktarmak. 5 için korteks, korteks-VTA ortak kültürleri 6, anestezi sıçan 6 ve in vivo 7 uyanık maymun, yüzeysel katmanları nöronal çığ sırasında nöronal ateşleme de ağırlıklı olarak LFP pik negatif sapma yakın oluşur (nLFP .) Bu nedenle, yerel olarak senkronize nöronal grupların uzaysal organizasyon nLFPs dizi 17 uzay ve zaman içinde ortaya çıkması ölçerek tahmin edilebilir . MEA Aktivite temporal kümeler halinde ortaya eğilimindedir, bu faaliyetin bir elektrot diğer sitelerde faaliyet eşlik ediyor. Birkaç saniye arayla meydana gelen 3 kümeleri komplo üzerine, bu tür faaliyet dönemlerinde LFP tipik dalga şekilleri Şekil 2A gösterilmiştir. Her küme için, negatif alan deplasmanlar 1 bir pencere içinde çeşitli elektrotlar görülebilir. S SD birden çok negatif bir eşik çapraz nLFP doruklarına açılan nLFP tepe kere şeklinde faaliyet nokta 'sütun' tesadüf nLFPs yakınında çeşitli elektrotlar (Şekil 2B) temsil eden bir raster uygun görüntülenmiştir. Bu faaliyetin Spatiotemporal organizasyonu oldukça karmaşık, daha az ya da çok düşük temporal çözünürlükte homojen görünüyor 'sütun', yüksek temporal çözünürlük ve böylece (Şekil 2C) ayrı kümeler oluşur. Aslında, Spatiotemporal nLFP kümeleri ortaya çıkması son derece kortikal ağlarda organize edilmektedir. Daha spesifik olarak, organizasyon nöronal çığ için ölçek değişmez. Bu, belirli bir zamansal çözünürlük ¨ t küme boyutları ihtimali hesaplanarak gösterilmiştir. Burada, kümeler aynı veya ardışık zaman kutuları (Şekil 2B) meydana nLFPs oluşmaktadır. Böyle bir küme boyutu Küme başına nLFPs veya Küme başına entegre nLFP amplitüdleri toplam sayısı olarak ifade edilir, küme boyutu dağılımları eğimi -1.5 2,4,5,7 gösterilmiştir güç hukuku, ortaya koymaktadır ( Şekil 2E, F). Bu dağıtım boyutları kxs, k sabit bir faktör oranı küme boyutları ölçek değişmeyen sipariş tanımlar unutmayın, s. bağımsız -1.5 k, Bu güç hukuku organizasyon dizi boyutu 2 bağımsız, temporal çözünürlük ¨ t 2 ve önemli nLFP tanımlamak için kullanılan eşik 7 fonksiyonudur. Nöronal grup büyüklüğü 7 ile nLFP genlik ölçekler, nLFPs ölçek değişmeyen örgütü ölçekli değişmeyen, yani fraktal, sipariş o yansıtırf yerel tüm boyutları içeren nöron gruplarının senkronize. Şekil 1 (A) monte MEA dişli cam yüzük ile yan ve üst görünümleri ve buna karşılık gelen kap. (B) inkübatör içinde. Sol: headstage inkübatör koşul altında, tek bir kültür kayıt için izin monte. Sağ: kültür büyümesi için çok sayıda ÇÇA tutarak Tepsi. Yan jantlar: alternatif kültür gelişimi için gerekli olan batık ve atmosfere maruz kalan faz step motor kontrollü sallanan cihaz. (C), korteks VTA co-kültür için kullanılan koronal sıçan dilimleri için şematik çizimi. VTA ventral tegmental alan (VTA gri) içeren Cortex bölümlerde (sol) ve beynin bölümleri (orta, sağ), kırık çizgileri boyunca keserek elde edilir. Ctx: korteks; wm: beyaz cevher; cpu: striatum; VTA: pons: pontin alan. 15 ile ilgili koronal plakaları da 8, 18, ​​ve 20 Bkz. (D), MEA ve kültürünün ilk 9 DIV gelişimi tek bir korteks-VTA ortak kültürler Yerleştirme ve büyüme. Kültür ve dizi ilerici genişleme, düzleşme unutmayın. Yansıtıcı doku parçaları, dejenere olmuş hücre ve doku artıkları göstermektedir. Sağlıklı doku, görünür ışık transillüminasyon altında opak ve grimsi. Şekil 2 kortikal Organotipik kültürler Nöronal çığ. (A) Overplot dizi spontan aktivite üç dönem, birkaç saniye ile ayrılır. Her faaliyet dönemi dizi birçok elektrotlar üzerinde olumsuz LFP deplasmanlar (her renk bir faaliyet dönemine etiketler) oluşur unutmayın. (B) her elektrot nLFPs Negatif tepe kez bir aktivite raster içine monte edilir. 'Column' benzeri yapılar yakın senkron aktivite dönemleri göstermiştir. (C), yüksek bir zaman ölçeği senkronize görünür sütun yüksek zamansal ölçeklerde (3 zamansal ölçeklerde gösterilen) birden fazla sütun oluşur unutmayın. (D) nöronal çığ algoritması şematik gösterimi. Gürültü SD-x bir eşik geçen olumsuz LFP deplasmanlar (nLFP), 2 x 2 elektrot dizi zirve zaman ve genlik tanımlanır. NLFPs uzaysal organizasyon genişliği ¨ t gittikçe aktif zaman bidonları içine kümelenmiş. NLFP aktif site sayısı, yani elektrotlar da bir küme boyutu tarafından belirlenen (s = 4) veya nLFP amplitüdleri entegre toplamı (s = 130 μV). Yaşam süresi, ¨ t katları ile ölçülür. (E, F) Güç hukuk küme boyutu dağıtım nöronal çığ gibi kümeleri tanımlar. Dizi (burada 200 mikron) Δd belirli bir interelectrode mesafeler seçim dinamikleri dikkate alınmalıdır hangi belirli bir ¨ t tanıtır unutmayın. Daha spesifik olarak, hangi oran Δd / ¨ t güç hukuk eğimi α nöronal çığ 2,4,5 -1.5 yaklasik hangi ağ ortalama yayılma hızı yakındır. Lütfen Şekil 2'de büyük halini görmek için buraya tıklayın .