JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
עברית

Automatically Generated
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Multi-אלקטרודה מערך הקלטות של מפולות העצבית תרבויות Organotypic

Published: August 01, 2011
doi:
10.3791/2949
, , , , ,
1Section on Critical Brain Dynamics,National Institute of Mental Health

Summary

דרך חזקים כדי ללמוד מפולות העצבית, כלומר בקנה מידה משתנה במרחב ובזמן פרצי פעילות, מעיד על דינמיקה מצב קריטי בקליפת המוח. מפולות לצאת באופן ספונטני בפיתוח בשכבות השטחיות של קליפת תרבותי המאפשר לטווח ארוך מדידות של הפעילות עם מערכים מישוריים משולב רב אלקטרודה (MEA) בתנאים מבוקרים בדיוק.

Abstract

קליפת המוח פעילה באופן ספונטני, גם בהיעדר קלט מסוים או פלט מוטורי. במהלך הפיתוח, פעילות זו חשובה ההגירה והבחנה של סוגי תאים בקליפת המוח ויצירת קשרים עצביים 1. ב החיה בוגרת, הפעילות השוטפת משקף את העבר את המצב הנוכחי של חיה שלתוכו גירויים חושיים משולבים בצורה חלקה לחשב פעולות עתידיות. לפיכך, הבנה ברורה של ארגון הפעילות השוטפת ספונטנית, כלומר היא תנאי הכרחי כדי להבין תפקוד הקורטקס.

טכניקות הקלטה רבים עולה כי הפעילות השוטפת בקליפת המוח מורכב של נוירונים רבים שפעילותם הפרט transiently סכום לאירועים גדולים יותר ניתן להבחין בפוטנציאל השדה המקומי (LFP) עם microelectrodes תאיים, או אלקטרואנצפלוגרם (EEG), magnetoencephalogram (MEG ), ואת האות מודגש בהדמיה מגנטית תפקודית (fMRI). LFP היא כיום שיטת הבחירה כאשר לומדים הפעילות העצבית האוכלוסייה עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוהה בקנה מידה mesoscopic (כמה אלפי נוירונים). בשלב microelectrode תאית, מסונכרן מקומית הפעילות של הנוירונים כתוצאה בשכנות מרחבית ב deflections המהירה LFP עד כמה מאות מיקרוולטים. כאשר באמצעות מערך של microelectrodes, ארגונים של סטיות כאלה יכולים להיות במעקב בנוחות במרחב ובזמן.

מפולות העצבית לתאר את ארגון בקנה מידה משתנה spatiotemporal של הפעילות העצבית במוח מתמשך 2,3. הם ספציפית בשכבות השטחיות של קליפת הוקמה במבחנה 4,5, in vivo בחולדה הרדים 6, ועל הקוף ער 7. חשוב לציין כי שני המחקרים תיאורטיים ואמפיריים 2,8-10 מראים כי מפולות העצבית מצביעים על הדינמיקה מאוזנת להפליא מצב קריטי של קליפת המוח אשר מייעל העברת המידע ועיבוד מידע.

כדי ללמוד את המנגנונים של פיתוח מפולת תחזוקה העצבית, ורגולציה, בהכנות במבחנה מועילים מאוד, מאחר שהם מאפשרים להקלטות פעילות יציבה מפולת בתנאים מבוקרים בדיוק. הפרוטוקול הנוכחי מתאר כיצד ללמוד מפולות העצבית במבחנה על ידי ניצול של הפיתוח שכבה שטחית organotypic תרבויות קליפה, תרבויות פרוסה כלומר, גדל על, מערכים מישוריים microelectrode משולב (MEA, וראו גם 11-14).

Protocol

1. זכוכית סטרילית, לשכת סגר עם MEA עבור לטווח ארוך הקלטות גלילים זכוכית הברגה עם טפלון פלסטיק כובע (אייס זכוכית), נדרש סגירה מאובטחת צמוד חדר תרבות, נחתכים (Aceglass) כ 2 מ"מ מהחלק התחתון של חוט (איור 1 א ', ב). טבעות זכוכית נקי על ידי שטיפה במים (3x) ו רותחים במשך 5 דקות בהוכחה 200 אתיל אלכוהול, בואו יבש. סיליקון פתרון Aliquot נדרש לצרף טבעות זכוכית על פני השטח MEA. מערבבים 15 מ"ל של חלקים A ו-B של ערכת Sylgard 184 אלסטומר סיליקון ביסודיות, בואו לשבת במשך 15 דקות כדי להסיר בועות אוויר, חנות 1 aliquots מ"ל ב -20 ° C. דבק טבעת הזכוכית של MEA (8×8 רשת W / אלקטרודה הקרקע פנימי, 30 מיקרומטר קוטר אלקטרודה, אלקטרודה 200/100 מיקרומטר בין המרחק עכברוש / עכבר) (איור 1 א ', ב). קח את 1 מ"ל של סיליקון (23 ° C) ב מזרק עם מחט מד קטן. החל סיליקון למשטח לחתוך unpolished של טבעת זכוכית, טבעת מרכז זכוכית על MEA, להחיל שכבה נוספת של סיליקון סביב החלק החיצוני של הטבעת חותם עבור חזקה יותר, לתת תרופה 1-2 שעות ב ~ 60 ° C על צלחת חמה. לעקר MEA קאמרית כמוסות קאמרית במנדף זרימה למינרית על ידי שטיפה במים 3x deionized ואחריו אלכוהול 70% (3 x, כי האחרון לשטוף לתת לשבת 10 דקות באלכוהול) ואחריו חשיפה של 10 דקות קאמרית הפנים כובע לאור UV . החיטוי MEA קאמרית (120 מעלות צלזיוס, לחות: 45 דק ') ולתת להתייבש. מעיל MEA משטח בתוך חדר תרבות עם פולי-D-ליזין. עבור MEAs חדש, אשר lipophilic למדי, מעיל על ידי שאיפה אגל חוזרות ונשנות של הפתרון מרשת אלקטרודה. עבור MEAs משמש, מכסים בתחתית קאמרית עם פתרון, לשאוב נוזל עודף, לאפשר להתאדות בתנאים סטריליים בתוך מכסה המנוע למינרית. צרף כובע לאטום MEA תא לאחסון לשימוש עתידי. 2. המצרכים הדרושים להכנת הצמיחה של תרבויות Organotypic ממיסים אגר סטרילי ב 0.9% NaCl, שופכים לתוך צלחת פטרי סטרילית (Falcon, 100 x15: ~ 5 רמת מ"מ), תן מגניב, ועוטפים סטרילי עם Parafilm לאחסון. Cut 20 x 10 x 5 מ"מ בלוקים של אגר מוצק לשימוש. חנות סופר דבק, למשל devcon Super Glue השנייה, עם האריזה מחה מטה עם EtOH 70% לפני הפתיחה, בתוך מכסה המנוע לזרום למינרית לשמור על סטריליות. הכן 50% D-גלוקוז (SIGMA אולטרה, G7528) על ידי הוספת 40 גרם של גלוקוז על 40 מ"ל מים מיוננים דה התרבות (Sigma). חנות ב 2 aliquots מ"ל ב -20 ° C. הוסף 4 מ"ל של 50% D-גלוקוז 500 מ"ל של תמיסת מלח מאוזן של גיי, ומקררים עד רפש (תערובת של נוזל / גבישי קרח) במקפיא לפני השימוש. עוף מחדש פלזמה במים 5 דה מיונן תרבות מ"ל (לנער עדין, למנוע היווצרות של בועות), לתת פתרון להסתפק 5-10 דקות, בעדינות מערבולת ו decantate התוכן ברור לתוך צלחת פטרי סטרילית. חנות פתרון פלזמה, 350 aliquot μl לתוך cryotubes (NuncTM), ב -20 ° C.; סטרילי-מסנן (פילטר חלבון 0.22 מיקרומטר נקבוביות) מחדש תרומבין מפלסמה שור בהתאם, סטרילי, מסנן (פילטר 0.22 מיקרומטר הנקבוביות), 40 aliquot μl לתוך cryotubes (NuncTM), חנות ב -20 ° C. עבור עובדים פתרון, לדלל 40 μl של הפתרון תרומבין ב μl 375 תמיסת מלח מאוזנת של גיי W / D-גלוקוז. הכן 400 מ"ל של מדיום התרבות ידי ערבוב 100 מ"ל של סרום סוס, 200 מ"ל בינוני הנשר בסל, 100 מ"ל שנאגרו של האנק תמיסת מלח שבה 4 מ"ל של גלוקוז 50% ו – 2 מ"ל של 200 מ"מ L-גלוטמין מתווספים. ניתן לאחסן 4-8 שבועות 100 מ"ל בקבוקים פיירקס ב 4 ° C. הכן מעכב מיטוזה ידי ערבוב uridine 0.3 מ"מ, 0.3 מ"מ ARA-C ציטוזין-β-D-arabinofuranoside, 0.3 ו -5 fluoro-2'-deoxyuridine, מסנן סטרילי, 200 μl aliquot ולאחסן ב -20 ° C ל – 6 12 חודשים. 3. Cortex ו הגחון שטח Tegmental (VTA) רקמות Dissection (זמן: <1 שעות) התשואות נוהל קליפת וחתכים VTA רקמה ~ 12 שיתוף תרבויות מן חולדות או עכברים, והיא מוכנה בתוך מכסה המנוע זרימה למינרית בתנאים סטריליים. סה"כ זמן לאיסוף רקמות צריך להיות יותר שעות 1. קח בריא, גורים ניזון היטב (גודל פסולת ~ 10: נוכחות של "כתם חלב" בטן) בשעה 1-2 ימים לאחר הלידה (PND). החזק גור בעדינות על ידי החוטם, לאפשר לו להסתובב בחופשיות, במהירות לערוף בבסיס הצוואר במספריים חדים. למען הסר המוח, להסיר את העור (שני חתכים מספריים לרוחב), לחתוך הגולגולת לפתוח עם מספריים בעין יפה (1 sagital חתך קו האמצע, 1 לחתוך את העטרה קליפת המוח / צומת המוח הקטן). פליפ בחזרה את כל 4 דשי הגולגולת. בעזרת מרית חידד, לחתוך חזיתית דרך הנורה חוש הריח, מרית מראש caudally מתחת למוח. הרם בעדינות את המוח מתוך הגולגולת ולתת לו להחליק לתוך פתרון סטרילי, צונן של גיי לקירור מהיר אחסון זמני. חזור על השלבים 3.2-3.3 עבור 2 מוחות יותר (הזמן הכולל: <20 דק '). כדי להשיג VTAרקמה, להעביר את המוח על צלחת סטרילי, פטרי יבש בעזרת מרית קטנה. יתר על כן להסיר בעדינות את הנוזלים העודפים על ידי הזזה כל המוח על 1 ס"מ הצידה. הסר גזע המוח על ידי חתך, העטרה אנכי ברמה של המוח הקטן באמצעות סכין גילוח. אגר דבק בלוק על הרכבה דיסק לייצוב מכני של המוח במהלך חיתוך ההליך. מניחים פס דק של דבק מגע כמה מילימטרים מול לחסום את אגר בדיסק (להימנע מלגעת בדבק אגר). בעזרת מרית קטנה, העברת הר כל המוח, מוט חזיתית למטה. ודא כי עמודי חזיתית מודבקים לדיסק גובר וכי הצדדים הגחון לגעת אגר ללא כל שאריות דבק על מנת להשיג ייצוב מכני תקין במהלך חיתוך קל להרים-off של פרוסות לחתוך. בזהירות לצלול דיסק התקנה מאובטח עם הרכבה המוח מגש vibratome (למשל לייקה VT1000) פתרון מלא, סטרילי צונן של גיי. עם סכין גילוח לנקות בזהירות (90% EtOH), לחתוך פרוסות העטרה של המוח התיכון בתדירות הרטט הגבוהה ביותר מהירות קדימה נמוכה יחסית בעובי של 400 500 מיקרומטר. בעזרת פיפטה פסטר הפוכה עם נורת שאיבה, להעברת ולאסוף פרוסות המכיל את VTA ב 35 x 10 מ"מ צלחות פטרי מלאות פתרון, סטרילי צונן של גיי (איור 1C; לראות צלחת העטרה גם 18-20 ב E22 ב 15). עבור קליפת סעיפים, שלבים 3.2-3.6, אבל להחיל חתך אנכי בין קורטקס המוח הקטן, ואת הר forebrains עם מוט חזיתית למעלה. כ 3 פרוסות העטרה (350 מיקרומטר עובי) החל ברמה של בסטריאטום נאספים לנתיחה קליפת בעתיד. בעזרת סכין מיקרו גרם של סכיני גילוח שבור, לנתח ~ 2 סעיף רחב מ"מ העטרה של קליפת המוח הקדמית ואזורי המוח התיכון המכיל את VTA (איור 1C) תחת stereomicroscope. איסוף קטעי רקמה בנפרד מנות קטנות (כגון מגלשות קאמרית) מלא של פתרון גיי צונן. 4. הרכבה Cortex ופרוסות VTA רקמות על MEA (Time: <1 שעה) מיקום MEA בטמפרטורת החדר תחת מיקרוסקופ סטריאו עם מערך אלקטרודות בפוקוס. מרכז טיפה 25 μl של פלזמה על נקי, אבק בחינם, מטריצה ​​סטרילי מערך אלקטרודות. שימוש spatulae קטן, בזהירות שקופית קליפת וסעיף VTA לתוך אגל פלזמה. מניחים על צלחת MEA קירור, ולמקד מבט, בואו צמרמורת ~ 15 עבור s, ולאחר מכן להוסיף 25 μl של תרומבין לתוך אגל פלזמה. משתמש קצה פיפטה תרומבין, להפיץ בזהירות את תערובת פלזמה / תרומבין עם תנועות מעגליות קטנות ברחבי MEA. אל תיגע מערך אלקטרודות ישירות שביר. בעדינות עמדה קליפת המוח על מערך הגבול עם הגב לאורך השורה האלקטרודה השנייה של המערך. בדרך זו, בשכבות שטחיות לפתח בסופו של דבר לכסות את התזכורת של המערך. VTA ממוקמת בסמוך לגבול הגחון סעיף קליפת המוח (איור 1D). שווי ו רופף לסגור את תא MEA כדי לשמור על לחות גבוהה ואילו הרכבה MEA / תרבות יושב 5 דקות ~ בתוך מכסה המנוע בטמפרטורת החדר כדי לאפשר קרישה פלזמה / תרומבין. בינתיים, חזור על שלב 4.1-4.3 עבור 3 תרבויות ועוד. בזהירות להוסיף 600 μl של המדיום תרבות טיפות קטנות לחדר התרבות באמצעות מזרק 1 סמ"ק עם 25 x 5 / 8 מחט. חזק לסגור את החדר ואת המקום MEA MEA / הרכבה תרבות על מגש אחסון נדנדה בתוך האינקובטור (איור 1B). כדי לזרז את ההליך, 3-4 MEAs ניתן התאספו רצפים חופפים. זמן האסיפה עבור 12 MEAs צריך להיות <1 שעות. אחרי 2 ימים במבחנה (DIV), להוסיף 10 μl של מעכבי מיטוזה. רענן תרבות מדיה ב -60% ב DIV 4 וכל 4 ימים לאחר מכן. 5. הקלטה אלקטרו הדור Stimulus כדי לבסס את הקשר בין סטיות משמעותיות פוטנציאל השדה המקומי (LFP) והנטייה של נוירונים לירות פוטנציאל פעולה, לאחר ~ 1 פעילות 5,6 שיא בשבוע ספונטנית בבית kHz 24 דקות 10 ~ מתוך כל אלקטרודה של MEA (חומרה : MEA1060 w / מעגל blanking, x1200 רווח, 12 bit A / D, 0-4096 מגוון mV, מערכות רב; תוכנה: MC_Rack). קרקע מסופק או, או חיצוני על ידי הוספת תא Ag / AgCl חצי דרך אלקטרודה הקרקע פנימי. הפרד את LFP עם מסנן הלהקה עוברים של 1-200 הרץ מפעילות ספייק תאיים (לעבור הלהקה 300 – 3000 הרץ). פעילות ספייק ניתן לסווג נוספת לתוך פעילות יחיד ורב באמצעות יחידת off-line sorters ספייק (למשל Plexon Inc). חישוב ספייק מופעלות ממוצעים של כל אלקטרודה. עבור תרבויות קליפה, רוב הממוצעים יזהה שלילי deflections LFP (nLFP) כמועד המועדף של spiking העצבית בתרבות. חישוב של כל אלקטרודה סף של סטיות תקן -3 הרעש (SD) של עקבות LFP (איור 2), לקבוע זמני שיא של אמפליטודות nLFPs כי לחצות סף (איור 2 ב, ג). בחרו סל זמן Δt (למשל בין 2-8 ms) ולזהות אשכולות nLFP spatiotemporal במערך ידי concatenating nLFPs מן האלקטרודה כל הנמצאים באותו bines זמן רצופים של Δt אורך (איור 2 ד; לפרטים לראות 2,4 , 5). על מנת לזהות מפולות העצבית, לחשב את הגודל של כל אשכול nLFP, למשל מספר אלקטרודות פעיל או סכום nLFP אמפליטודות, לבנות היסטוגרמה גודל, העלילה פעמיים לוגריתמי קואורדינטות. עבור מפולות העצבית, חלוקת גודל בעקבות חוק כוח מקורב בקו ישר פעמיים לוגריתמי קואורדינטות 2 (2E איור, F). הצג 16 עבור בדיקות סטטיסטיות על חוקים כוח. לעורר תגובה עורר ברקמת ידי בחירת אלקטרודה שדרכה הנוכחית שבשליטת גירויים עם משרעת S מוחלים (גנרטור Stimulus STG 1008, מערכות רב). כדי להפחית את הנזק אלקטרודה, שימוש מגוון מצומצם, תשלום נייטרלי גירוי של זעזועים יחיד עם הפרעה דו מרובע waveform: 50 μs עם משרעת-S ואחריו 100 μs עם משרעת + S / 2 ו-S בין 10-200 μA. עיין במדריך של הבעלים לקבלת פרטים נוספים. כדי להקליט את הטווח הדינמי 9, גירוי רשמה שיא התגובות LFP בשיעור 4 kHz הדגימה על כל האלקטרודות הבאות 500 מילישניות לאחר הגירוי. השתמש blanking המעגלים (Multi-channel מערכות), אשר מנתק את הבמה מגברי ראש במהלך גירוי להפחית חפצים הגירוי כדי למנוע הרוויה קדם מגבר. 6. נציג תוצאות: עם MEAs חדש על 8-9 מתוך 10 תרבויות ישרוד במשך שבועות רבים. רוב ההקלטות ארוכת הטווח שלנו מתקיימים בתוך האינקובטור במדיום תרבות, אשר מאפשרת לנו לעקוב אחר התפתחות של תרבויות בודדים במהלך שבועות רבים 5. בהתבסס על הניסויים שלנו, הקלטות LFP ניתן להשיג באופן אמין עם MEAs בשימוש במשך יותר מ 100 ימים תרבות. לעומת זאת, פעילות תאית ספייק הוא יותר למדידה באופן מהימן עם MEAs חדש יחסית (<40 יום תרבות). בניסוי אופייני, אנו מעבירים MEA ממגש האחסון (איור 1B, מימין) למגש עם השלב ראש המצורפת (איור 1B, משמאל) שמירה על תא התרבות אטום. במשך 5 הקורטקס, קליפת-VTA שיתוף תרבויות 6, כמו גם החולדה הרדים 6 ואת קוף ער in vivo 7, ירי עצבי במהלך מפולות נוירונים בשכבות השטחיות מתרחשת בעיקר קרוב הסטייה השלילית השיא של LFP (nLFP ). לפיכך, הארגון spatiotemporal של קבוצות נוירונים מסונכרן מקומית יכולה להיות מוערך על ידי מדידת המופע של nLFPs במרחב ובזמן על 17 המערך. פעילות על MEA נוטה להופיע באשכולות הזמני, כגון פעילות על האלקטרודה אחד מלווה פעילות באתרים אחרים. גל אופיינית של LFP במהלך תקופות פעילות כגון מוצגים 2A דמות, על ידי התוויית 3 אשכולות המתרחשים כמה שניות זה מזה. עבור כל אשכול, deflections בתחום השלילי ניתן לראות כמה אלקטרודות בתוך חלון של 1 s. כאשר לחילוץ פסגות nLFP כי לחצות סף של SD שליליות רבות, את הפעילות בצורה של nLFP שיא פעמים הוא מדמיין בנוחות סריקה בו "עמודות" של נקודות מייצגים ליד nLFPs חופפות על אלקטרודות שונות (איור 2B). ארגון spatiotemporal של פעילות זו היא מורכבת למדי: "עמודות", אשר מופיעים פחות או יותר הומוגני ברזולוציה הטמפורלית נמוך, מורכבים אשכולות נפרדים ברזולוציה הטמפורלית גבוהה וכן הלאה (איור 2C). למעשה, הופעתה של spatiotemporal אשכולות nLFP מאורגן מאוד ברשתות בקליפת המוח. באופן ספציפי יותר, הארגון הוא בקנה מידה משתנה עבור מפולות עצביים. זו באה לידי ביטוי על ידי חישוב ההסתברות באשכולות ב Δt ניתנה החלטה הזמני. הנה, אשכולות מורכבים nLFPs המתרחשים פחי זמנית או בזה אחר (איור 2 ד). כאשר גודל של אשכול כזה בא לידי ביטוי המספר הכולל של nLFPs לכל אשכול, או משולב nLFP אמפליטודות לכל אשכול, גודל הפצות אשכול מגלה חוק החשמל, אשר מדרון הוכח להיות 2,4,5,7 -1.5 ( איור. 2E, F). שים לב הפצה זו מזהה הזמנת בקנה מידה משתנה בגדלים מצרר הוא היחס בין גדלים של kxs, כאשר k הוא גורם קבוע, הוא k -1.5, שאינה תלויה s. ארגון זה חוק החשמל ללא תלות בגודל של המערך 2, הרזולוציה הטמפורלית Δt 2, ועל סף המשמש לזיהוי nLFP משמעותי deflections 7. בגלל קשקשים nLFP משרעת עם גודל הקבוצה העצבית 7, ארגון בקנה מידה משתנה של nLFPs משקף בקנה מידה משתנה, כלומר פרקטל, o הזמנתf מסונכרן מקומית קבוצות נוירונים הכוללים בכל הגדלים. באיור 1. (א) הצד העליון תצוגות של MEA עם טבעת זכוכית מושחל רכוב, וכובע תואם. (ב) בתוך נוף של החממה. משמאל: headstage הר המאפשר הקלטה מתרבות אחת בתנאי חממה. מימין: מגש מחזיק MEAs רבים לצמיחה תרבות. הגלגלים לוואי: דריכה המכשיר נשלט מנוע נדנדה עבור לסירוגין שלב שקוע והאווירה חשוף נדרש לצמיחה תרבות. (ג) ציור סכמטי של פרוסות עכברוש העטרה המשמש Cortex-VTA שיתוף תרבויות. סעיפים Cortex (משמאל) וחתכים המוח התיכון (באמצע, מימין) המכיל את אזור VTA tegmental הגחוני (VTA, אפור) מתקבלים על ידי חיתוך לאורך קווי שבר. CTX: קליפת: wm: החומר הלבן; מעבד: בסטריאטום; VTA: פונס: אזור pontine. ראה גם צלחות העטרה המקביל 8, 18, ​​20 על ידי 15. (ד) מיקום וצמיחה של קליפה-VTA יחיד שיתוף תרבויות על MEA והתפתחותה לאורך DIV 9 ראשון תרבות. הערה השטחת התרבות והרחבת המתקדמת שלה על המערך. חלקי רקמה רפלקטיבית מצביעים תאים מנוונים ופסולת רקמות. רקמה בריאה הוא אטום אפרפר תחת שקוף עם האור הנראה. איור 2. מפולות העצבית בתרבויות organotypic קליפת המוח. (א) Overplot של תקופה של שלושה של פעילות ספונטנית על המערך, מופרדים על ידי כמה שניות. שים לב כי כל תקופת הפעילות מורכבת deflections LFP שלילית על אלקטרודות רבות על המערך (כל צבע תוויות תקופה אחת הפעילות). (ב) פעמים שיא שלילי של nLFPs של כל אלקטרודה הם התאספו לתוך סריקה של פעילות. "Column' מבנים דמויי ציין תקופות של פעילות סינכרונית הקרוב. (ג) שים לב העמודות המופיעות מסונכרן מאוד בקנה מידה פעם אחת מורכבת עמודות מרובות על המאזניים הזמני גבוה יותר (3 סולמות הזמני מוצג). (ד) ייצוג סכמטי של אלגוריתם מפולת עצביים. ביום 2 x 2 בזמן שיא מערך אלקטרודה שלילית של משרעת deflections LFP (nLFP) חציית הסף של x-SD הרעש מזוהים. ארגון Spatiotemporal של nLFPs הוא מקובצים לתוך פחי זמן פעיל ברציפות של Δt רוחב. גודלו של צביר מזוהה על ידי המספר או של אתרים פעילים, כלומר עם אלקטרודות nLFP (s = 4), או סכום משולב של nLFP אמפליטודות (s = 130 μV). השעה החיים נמדדת בכפולות של Δt. (E, F) חוק חשמל הפצה גודל האשכול מזהה אשכולות כמו מפולות עצביים. ראוי לציין, כי הבחירה של מרחקים interelectrode מסוים Δd עבור המערך (כאן 200 מיקרומטר) מציג Δt מסוים שבו יש את הדינמיקה ציין. ליתר דיוק, היחס שבו Δd / Δt המדמה את מהירות התפשטות הממוצע ברשת, שבו α מדרון החוק הכוח המדמה -1.5 עבור מפולות העצבית 2,4,5. אנא לחץ כאן כדי לראות גרסה גדולה יותר של הדמות 2.

Discussion

1. בעיות טכניות:

  1. טכניקה סטרילית. הכנה של MEAs והכנת תרבות מבוצעות כל בתנאים סטריליים בתוך מכסה המנוע זרימה למינרית. אנטיביוטיקה, אשר משפיעים על הפעילות העצבית, אינן משמשות בכל עת במהלך תהליך הכנה התרבות.
  2. פלזמה / תרומבין קרישה ועמידה רקמה על ההישרדות MEA. הרקמה על MEA דורש איזון זהיר בין הזמן הדרוש קרישה פלזמה / תרומבין וזמן החשיפה רקמות לאווירה. זמן קצר סיכונים קרישה מוקדמת ניתוק של חלקים מן MEA, תוך חשיפה ממושכת אווירה מעוררת ניוון הרקמה. בגלל הכוח של הפתרון תרומבין קובע את המהירות של תהליך הקרישה, היא פרמטר חשוב מאוד בהצלחה מצרף, תרבויות בריא על פני השטח MEA. אנו משיגים את התוצאות הטובות ביותר באמצעות 1,000 יחידות (1KU: 1 יחידה NIH = 0.324 ± 0.073 מ"ג). חשוב לציין, ערבוב שלם של התוצאות פלזמה / תרומבין פתרון קרישה הטרוגניות מרחבית קידום פלזמה נקרע במהלך culturing. "חורים" אלה פלזמה קשה להשפיע על בריאות תרבות לנתק את התרבות מן microelectrodes, ובכך להתפשר על איכות ההקלטה אלקטרו. עבודה עם לוחות קירור במהלך MEA / רקמה הרכבת מאטה את קרישת ומאפשר ערבוב אחיד של פתרון פלזמה / תרומבין ומיקום נכון של קטעים רקמות.
    באופן דומה, על ידי הוספת בינוני טיפות יחיד לחדר תרבות כדי להטביע את תרבות לאחר 5 דקות בלבד של קרישה, מקטינה באופן משמעותי את הסיכון של פלוגות רקמות עקב מתחים על פני השטח. תרבות מוצלח יהיה לרדד על MEA ומעט להרחיב מראה צמיחה בריאה במשך שבועות, ללא כל הסימנים העיקריים של מגע רקמות MEA שלם או התנוונות רקמות (למשל איור. 1D).
  3. דיסקציה רקמות. סכינים מיקרו השתפרו מאוד בתהליך לנתיחה שלנו. אנו משתמשים כפולה גילוח קצה להבי (כלים המדע פיין – להבי אזמל שביר – 100050-00), שממנו אנו לפצל ~ 2 מ"מ רוחב "להבים" באמצעות צבת, ולהחזיק אותם עם בעל אזמל. דגימות רקמה גזור מן הפרוסה העטרה באמצעות תנועה חלקה, חברת אנכי של הלהב ובכך מקטינים מאד את הלחץ המכני עקב משיכה של רקמה הכוללת שיפור הבריאות והתרבות.
  4. רקמות קירור. קירור נכון של פרוסות וחתכים רקמות במהלך הכנת חיוני להצלחת התרבות. אנו משתמשים מחוייט צלחות קר בנוי מרכיבים Peltier מצורף מתחת לדיסק מתכת. החום המיוצר על ידי אלמנט Peltier מוסר באמצעות טפטוף מים קרים. זה מצמצם מאוד זמן הכנה סטנדרטיזציה קירור במהלך כל שלב ההכנה (Dold מעבדות הנדסה 131 פלנטיישן ד"ר Seguin, TX 78155;. (830) 560-1471)).
  5. תנאי חממה. מחוייט עם חממה מדויק התנאים נדנדה פנימי כבר חיונית להצלחה שלנו בטיפוח פרוסות על MEAs. בהתבסס על מקורי בתוך הבית על ידי עיצוב Multichannelsystems (כרגע לא זמינים מסחרית), המכשיר נדנדה פנימי מורכב מגשי המצורפים שני גלגלים בצד גדול. מנועים דורך בקרות ממוחשבות לאפשר מסלול נדנדה מדויק (נדנדה זווית, מהירות נדנדה, ועל הפסקות לסירוגין). בסופו של דבר, תרבויות פרוסה צריכים להיות חשופים בינוני האווירה והתרבות לסירוגין איטי. הגישה המסורתית היא גישת למקום תרבויות פרוסה לתוך צינורות צרים לאט לסובב לאורך הציר הארוך ביותר שיש. הנה, סיבוב איטי אינו מייצר לחץ מכני בשל הסיבוב עצמו, את מהירות סיבוב גבוהה מספיק כדי להשיג אופטימלי "האכלה / נשימה" מחזור של כ 5-10 דקות משך. הפנים קומפקטית יותר של תא MEA, הנפח הכולל של סמ"ק 2 ~, ואת התרבות קטנים, בינוניים בהיקף הנדרש עבור מיזוג בינוני על ידי הרקמה עצמה, מהווה אתגר משמעותי. מטלטלות MEA בין זווית ° ± ~ 70 (זמן המחזור: ~ 200 ים), להאט את מהירות הנדנדה כמו מעברים בין שלב תרבות האווירה נוזלי, ועצר את הנדנדה בזוויות קיצוניות של חשיפה ממושכת לאווירה יש היה חיוני להישרדות התרבות.

2. גיל התפתחותית של תרבויות קליפת ללמוד מפולות העצבית

פרוסות חריפה של הקורטקס עכברוש נלקחים בדרך כלל על PND 0-1 ותרבותי במשך שבועות רבים על MEA. מחקרים מוקדמים הראו בבירור כי פרוסה אחת התרבויות קליפה, לאחר מספר שבועות במבחנה, לשמור על מבנה מרובד עם סוגי תאים לזיהוי כי ניתן להשוות בקלות בכיתות תא vivo 18,18-21. הארגון שכבתית זו במערכת במבחנה נעשה שימוש נוח ללמוד thalamicהעצבוב של קליפת המוח במהלך ההתפתחות 22-24, כמו גם על נהיגה מבנים קורטיקליים כגון בסטריאטום 25,26. למעשה, סגוליות ביצירת קשרים עצביים בתוך ועל פני אזורים במוח מאפשר בנייה של מערכות מורכבות במבחנה כי רבים לשחזר את מערכות ההקרנה מפורט, כגון זה של הגרעינים הבזליים, קליפת המעגלים 27-30.

לאחר 4-6 שבועות במבחנה, יחיד פרוסות קליפת 31 פרוסות קליפת שיתוף תרבותי עם הסטריאטום 26 או 32 התלמוס להראות ספונטני למעלה ולמטה מדינות נמצא בדרך כלל החולדה urethane הרדים 33 in vivo. הארגון הזמני קנס של אלה מעלה מדינות הנושאת את סימן ההיכר של מקוננות θ-ו γ-תנודות מעיד על רשת בוגרים electrophysiologically של עצב פירמידליים מהיר spiking interneurons GABAergic 31. חשוב לציין, בהעדר גירוי D2 קולטן דופמין, ההבשלה של parvalbumin חיובי interneurons קליפת המוח מתפרסמים בהשהייה של כ -2 שבועות בתרבויות קליפת פרוסה 34. בקנה אחד עם ממצאים אלה, כמובן זמן התפתחותי של מקוננות-θ, β ו-γ-תנודות משתווה לזה in vivo כאשר פרוסות קליפת הם שיתוף תרבותי עם האזור tegmental הגחוני (VTA), אשר מכיל נוירונים דופאמינרגיים מקרין על קליפת המוח 6.

מחקרים אלה מצביעים על כך כאשר לומדים מפולות העצבית, אשר מכריע תלוי עיכוב בוגרת GABAergic מהיר נמצאים בשכבות השטחיות של קליפת 2,4, בזהירות רבה יש לנקוט כדי להבטיח הבשלה תקינה של רקמת קליפת המוח. בעוד מפולות העצבית להתעורר בתרבויות קליפת יחיד במשך זמן של 2-5 שבועות, 4, כאשר נדרשת כמובן זמן התפתחותי זה תואם את התפתחות vivo, פרוסות קליפת צריך קולטן דופמין המתאים גירוי, למשל על ידי שיתוף culturing פרוסות קליפת המוח עם VTA 6.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה מומן על ידי מחלקת המחקר של תכנית עירונית (DIRP) של המכון הלאומי לבריאות הנפש, המכונים הלאומיים לבריאות.

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Integrated planar multielectrode array Multichannel Systems (www.multichannelsystems.com)
ALA Scientific Instruments
(www.alascience.com)		 200/30iR-ITO-w/o Titanium Nitrate (TiN) electrodes (30 mm diameter) have large surface resulting in low impedance ( ~1.5 kΩ at 1 kHz) and excellent wide-band recordings ( w/o – without ring)
Chamber glass www.aceglass.com 7620-32 Threaded glass cylinder
Chamber cap www.aceglass.com 7622-114 Plastic cap with Teflon insert
Sylgard 184 www.wpiinc.com SYLG184 Two-part silicone elastomer
Poly-D-lysine Sigma-Aldrich P6407-5mg γ-irradiated, lyophilized powder, cell cultured tested. Reconstituted with 5 ml deionised water before use.
Gey’s Balanced Salt solution Sigma-Aldrich G9779-500mL sterile filtered and cultured tested
chicken plasma Sigma-Aldrich P3266-5mL Lyophilized, reconstitute with 5 ml deionized water before use.
thrombin Sigma-Aldrich T6634-1KU from bovine plasma, lyophilized powder form.
horse serum Sigma-Aldrich H1138-100mL donor herd, heat inactivated, cell culture tested
Basal Medium Eagle Invitrogen 21010-046 1x, 500 ml – (+) Earle’s Salts, (-) L-glutamine),
Hank’s Buffered Saline Solution Invitrogen 24020-117 500 ml – (+) Magnesium, (+) calcium, w/phenol red)
Chamber slides Lab-Tek-Chamber Slide w/cover (Nunc), sterile 177429
Uridine Sigma-Aldrich U3003
ARA-C cytosine-β-D-arabinofuranoside Sigma-Aldrich C6645
5-fluoro-2’-deoxyuridine Sigma-Aldrich F0503
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Spitzer, N. C. Electrical activity in early neuronal development. Nature. 444, 707-712 (2006).
  2. Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches in neocortical circuits. J. Neurosci. 23, 11167-11177 (2003).
  3. Beggs, J. M., Plenz, D. Neuronal avalanches are diverse and precise activity patterns that are stable for many hours in cortical slice cultures. J Neurosci. 24, 5216-5229 (2004).
  4. Stewart, C. V., Plenz, D. Inverted-U profile of dopamine-NMDA-mediated spontaneous avalanche recurrence in superficial layers of rat prefrontal cortex. J. Neurosci. 26, 8148-8159 (2006).
  5. Stewart, C. V., Plenz, D. Homeostasis of neuronal avalanches during postnatal cortex development in vitro. J. Neurosci. Meth. 169, 405-416 (2007).
  6. Gireesh, E. D., Plenz, D. Neuronal avalanches organize as nested theta- and beta/gamma-oscillations during development of cortical layer 2/3. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 7576-7581 (2008).
  7. Petermann, T. Spontaneous cortical activity in awake monkeys composed of neuronal avalanches. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 106, 15921-15926 (2009).
  8. Kinouchi, O., Copelli, M. Optimal dynamical range of excitable networks at criticality. Nature Physics. 2, 348-351 (2006).
  9. Shew, W. L., Yang, H., Petermann, T., Roy, R., Plenz, D. Neuronal avalanches imply maximum dynamic range in cortical networks at criticality. J. Neurosci. 29, 15595-15600 (2009).
  10. Shew, W. L., Yang, H., Yu, S., Roy, R., Plenz, D. Information capacity is maximized in balanced cortical networks with neuronal avalanches. J Neurosci. 5, 55-63 (2011).
  11. Karpiak, V., Plenz, D. Preparation and maintenance of organotypic cultures for multi-electrode array recordings. Current Protocols in Neuroscience. 1, 6-6 (2002).
  12. Hammerle, H., Egert, U., Mohr, A., Nisch, W. Extracellular recording in neuronal networks with substrate integrated microelectrode arrays. Biosens. Bioelectron. 9, 691-696 (1994).
  13. Nisch, W., Bock, J., Egert, U., Hammerle, H., Mohr, A. A thin film microelectrode array for monitoring extracellular neuronal activity in vitro. Biosens. Bioelectron. 9, 737-741 (1994).
  14. Egert, U. A novel organotypic long-term culture of the rat hippocampus on substrate-integrated multielectrode arrays. Brain Res. Protoc. 2, 229-242 (1998).
  15. Altman, J., Bayer, S. A. . Atlas of Prenatal Rat Brain Development. , (1995).
  16. Clauset, A., Shalizi, C. R., Newman, M. E. J. Power-law distributions in empirical data. arXiv. , (2009).
  17. Plenz, D., Thiagarajan, T. C. The organizing principles of neuronal avalanches: cell assemblies in the cortex?. Trends Neurosci. 30, 101-110 (2007).
  18. Cäser, M., Bonhoeffer, T., Bolz, J. Cellular organization and development of slice cultures from rat visual cortex. Exp. Brain Res. 477, 234-244 (1989).
  19. Cäser, M., Schüz, A. Maturation of neurons in neocortical slice cultures. A light and electron microscopic study on in situ and in vitro material. J. Hirnforsch. 33, 429-443 (1992).
  20. Götz, M., Bolz, J. Development of vasoactive intestinal polypeptide (VIP)-containing neurons in organotypic slice cultures from rat visual cortex. Neurosci. Lett. 107, 6-11 (1989).
  21. Götz, M., Bolz, J. Formation and Preservation of cortical layers in slice cultures. J. Neurobiol. 23, 783-802 (1992).
  22. Bolz, J., Novak, N., Götz, M., Bonhoeffer, T. Formation of target-specific neuronal projections in organotypic slice cultures from rat visual cortex. Nature. 346, 359-362 (1990).
  23. Bolz, J., Novak, N., Staiger, V. Formation of specific afferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus. J. Neurosci. 12, 3054-3070 (1992).
  24. Novak, N., Bolz, J. Formation of specific efferent connections in organotypic slice cultures from rat visual cortex cocultured with lateral geniculate nucleus and superior colliculus. Eur. J. Neurosci. 5, 15-24 (1993).
  25. Plenz, D., Aertsen, A. Neural dynamics in cortex-striatum co-cultures. I. Anatomy and electrophysiology of neuronal cell types. Neurosci. 70, 861-891 (1996).
  26. Plenz, D., Aertsen, A. Neuronal dynamics in cortex-striatum co-cultures. II. Spatio-temporal characteristics of neuronal activity. Neurosci. 70, 893-924 (1996).
  27. Plenz, D., Kitai, S. T. Organotypic cortex-striatum-mesencephalon cultures: the nigro-striatal pathway. Neurosci. Lett. 209, 177-180 (1996).
  28. Plenz, D., Kitai, S. T. Up’ and ‘down’ states in striatal medium spiny neurons simultaneously recorded with spontaneous activity in fast-spiking interneurons studied in cortex-striatum-substantia nigra organotypic cultures. J. Neurosci. 18, 266-283 (1998).
  29. Plenz, D., Herrera-Marschitz, M., Kitai, S. T. Morphological organization of the globus pallidus-subthalamic nucleus system studied in organotypic cultures. J. Comp. Neurol. 397, 437-457 (1998).
  30. Plenz, D., Kitai, S. T. A basal ganglia pacemaker formed by the subthalamic nucleus and external globus pallidus [see comments]. Nature. 400, 677-682 (1999).
  31. Plenz, D., Kitai, S. T. Generation of high-frequency oscillations in local circuits of rat somatosensory cortex cultures. J Neurophysiol. 76, 4180-4184 (1996).
  32. Klostermann, O., Wahle, P. Patterns of spontaneous activity and morphology of interneuron types in organotypic cortex and thalamus-cortex cultures. Neurosci. 92, 1243-1259 (1999).
  33. Cowan, R. L., Wilson, C. J. Spontaneous firing patterns and axonal projections of single cortico-striatal neurons in the rat medial agranular cortex. J. Neurophysiol. 71, 17-32 (1994).
  34. Porter, L. L., Rizzo, E., Hornung, J. P. Dopamine affects parvalbumin expression during cortical development in vitro. J Neurosci. 19, 8990-9003 (1999).

Tags

Multi-electrode Array RecordingsNeuronal AvalanchesOrganotypic CulturesCortex ActivityOngoing ActivitySpontaneous ActivityMigration Of Cortex Cell TypesFormation Of Neuronal ConnectionsSensory Stimuli IntegrationCortex FunctionRecording TechniquesLocal Field Potential (LFP)Extracellular MicroelectrodesElectroencephalogram (EEG)Magnetoencephalogram (MEG)BOLD SignalFunctional Magnetic Resonance Imaging (fMRI)Mesoscopic ScaleSynchronized ActivitiesDeflections In LFPArray Of Microelectrodes

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Plenz, D., Stewart, C. V., Shew, W., Yang, H., Klaus, A., Bellay, T. Multi-electrode Array Recordings of Neuronal Avalanches in Organotypic Cultures. J. Vis. Exp. (54), e2949, doi:10.3791/2949 (2011).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image