器官培養における神経雪崩のマルチ電極アレイの録音

1。長期録画用MEAと滅菌、密閉式ガラスチャンバー安全性とタイトな培養チャンバーの閉鎖に必要なテフロンプラスチックキャップ（エースガラス）、、とスレッド化ガラスシリンダー（Aceglass）スレッドの底部（図1A、B）から約2 mmにカットされています。水（3倍）と200プルーフエチルアルコールで5分間煮沸して洗浄して清浄なガラスリングは、乾燥させる。 MEAの表面にガラスリングを取り付けるために必要な一定分量のシリコンソリューション。 Sylgard 184シリコーンエラストマーのキットの＆Bは、徹底的に、-20℃で1mlのアリコートに店舗、気泡を除去するために15分間放置します部品の15 mlを混ぜて MEAに接着剤のガラスリング（8 × 8のグリッドのw /内部接地電極、ラット/マウス用の30μmの電極の直径、100分の200μmの電極間の距離）（図1A、B）。小さなゲージの針付き注射器でシリコンを1 ml（23℃）を取り上げる。 〜60℃のホットプレート上で2時間 – ガラスリング、MEA上の中央のガラスリング、強力なシール用リングの外側を、シリコンの層を追加適用の未研磨の切断面にシリコーンを適用、1に治すことができます。 紫外線にチャンバーとキャップ内部の10分露光に続いて、70％アルコールに続いて（最後のためにアルコールで10分間放置しますリンス3 ×）、脱イオン水でリンス3倍で層流フードでMEAチャンバーとチャンバーキャップを滅菌。オートクレーブMEA室（120℃、ウェット、45分）と乾燥させる。 ポリ- D -リジンでコーティングMEAの表面培養チャンバー内の。用ではなく、親油性である新しい多国間環境協定、、電極のグリッドからのソリューションの繰り返し滴の吸引コート。使用される多国間環境協定の場合は、ソリューションを持つチャンバーの底部をカバーする、余分な液を吸引し、層流フード内無菌条件下で蒸発させる。ストレージおよび将来使用するためにシールMEA室にキャップを取り付けます。 2。器官培養の調製と成長に必要な成分滅菌ペトリ皿（ファルコン100 X15;〜5mmのレベル）に注ぐ、0.9％NaCl中で無菌の寒天を溶かし、冷ます、およびストレージ用のパラフィルムで滅菌ラップ。用固形寒天から20 × 10 × 5mmのブロックをカット。 パッケージングと店舗スーパー接着剤、例えば、DevConのスーパー接着剤IIは、無菌性を維持するために層流フードの内部で、開く前に、70％エタノールでダウン拭った。 脱イオン化文化の40mlの水（Sigma社）にグルコース40gを添加することにより50％D -グルコース（SIGMA超、G7528）を準備する。 -20℃で2 mlのアリコートの店 Geyの平衡塩類溶液500mlに50％D -グルコースの4 mlを加え、そして使用前に冷凍庫でスラッシュ（液体/氷結晶の混合物）に冷やします。 5ミリリットルの脱イオン文化の水の再構成の鶏の血漿（優しく振る、気泡の形成を避けるため）、ソリューションが5に甘んじることができます – 10分、静かに渦巻き、そして滅菌シャーレに明確なコンテンツをdecantate。滅菌フィルター（0.22μm孔フィルター、蛋白質）-20℃でプラズマのソリューション、クリオチューブに分注し350μlの（NuncTM）、店舗クリオチューブ（NuncTM）に応じて牛血漿からの再構成のトロンビン、滅菌フィルター（0.22μm孔フィルター）、アリコート40μlの、-20℃で保存します。ソリューションを操作するための、Geyの平衡塩類溶液W / D -グルコースの375μlのトロンビン溶液の40μlを希釈する。 ウマ血清、200ミリリットル基礎培地イーグル、50％グルコースと200 mMのL -グルタミンを2ml 4mlのが追加される100ミリリットルハンクス緩衝生理食塩溶液100 mlを混合して培養液400 mlを調製。 4℃で8週間100ミリリットルパイレックスのボトル℃と – 4を格納することができます 0.3mmのウリジン、0.3mMのARA – Cシトシン-β- D -アラビノフラノシド、および0.3mMの5 – フルオロ-2' – デオキシウリジン、滅菌フィルタ、分注して200μlの、6、-20℃で保存を混合することによって有糸分裂阻害剤を準備する – 12ヶ月。 3。皮質と腹側被蓋野（VTA）組織の解剖（時間：<1時間） プロシージャ利回りラットやマウスから〜12共培養のための皮質とVTAの組織切片、および無菌条件下で層流フードの内部に用意されています。組織採取のための合計時間は1時間以上でなければなりません。 2生後日数（PND） – 1で、健康的な、よく栄養仔（腹部"ミルクのスポット"の存在仔数〜10）を取る。鼻でそっと子犬を保持し、それが自由にハングアップすることができます、とすぐに切れるはさみで首の基部に首を切る。 脳を除去するため、（2つの側面シザーカット）皮膚を取り除く、細かい目のはさみ（1矢状正中線のカット、皮質/小脳ジャンクショ​​ンで1冠状カット）でオープン頭蓋骨をカット。すべての4頭蓋骨のフラップをバックフリップ。シャープスパチュラで、嗅球、尾側の脳の下に事前にへらを通して正面を切る。ゆっくりと頭蓋骨から脳を持ち上げ、それが急速な冷却と一時記憶用の滅菌、チルド、Geyの溶液中にスライドさせてみましょう。さらに2頭（：<20分合計時間）のためのステップ3.2から3.3を繰り返します。 VTAを取得するには組織は、小さなヘラを使って滅菌、乾燥ペトリ皿の上に脳を転送する。さらに静かに横に約1cmの各脳をスライドさせて余分な水分を取り除く。カミソリの刃を使用して小脳のレベルで冠状、垂直カットで脳幹を削除します。 手順をスライス中に脳の機械的な安定化のためにディスクをマウントする場合、接着剤の寒天ブロック。瞬間接着剤の細い線を配置し、ディスク上の寒天ブロックの前に数ミリメートル（寒天に触れない接着剤を避けるため）。 小さなヘラを使用して、ダウン、前頭極を転送し、各脳をマウントします。前頭極が取り付けディスクに接着されていると腹側の側面は、中にカットスライスのカットと簡単なリフトオフ。適​​切な機械的安定を達成するために任意の接着剤の残留物なしで寒天に触れていることを確認してください滅菌、冷却したGeyの溶液で満たされたビブラトームトレイ（例えばライカVT1000）で脳のアセンブリと慎重に沈めると、安全なディスクをマウント。慎重に洗浄かみそりの刃（90％エタノール）で、最も高い振動周波数での中脳の冠状スライスをカットし、400 500μmの厚さで、比較的低い前進速度。吸引器と反転パスツールピペットを用いて、（; – 15のE22で20にも冠状板18を参照して図1C）、滅 ​​菌、冷却したGeyの溶液で満たされた35 x 10 mmのペトリ皿にVTAを含むスライスを転送して収集する。 皮質のセクションは、手順3.2の – 3.6が、前頭極、最大で縦皮質と小脳の間のカット、およびマウントforebrainsを適用します。線条体のレベルから始めて約3冠状スライス（350μmの厚さ）は、将来の皮質の解剖のために収集されます。 壊れたかみそりの刃で作られたマイクロナイフを使用して、実体顕微鏡下でVTAを（図1C）を含む前頭皮質と中脳領域の約2 mm幅の冠状断面を詳細に分析します。チルドGeyの溶液で満たされた小さな料理（例えばチャンバースライド）で別々に組織切片を収集する。 4。 MEA上のCortexとVTAの組織切片をマウントする（時間：<1時間） 焦点の電極アレイ付きステレオ顕微鏡下で、室温でMEAを置きます。中央クリーン、無塵、無菌電極アレイのマトリックス上にプラズマの25μlの液滴。小さなspatulaeを使用して、慎重にプラズマ液滴に皮質やVTAセクションをスライドさせます。 〜15秒のために寒さを聞かせ、表示する再び焦点、冷却板のMEAを置き、プラズマ液滴にトロンビン25μlを加える。トロンビンピペットチップを使用して、慎重にMEA間の小さな円形の動きとプラズマ/トロンビン混合物を広げる。直接脆性電極アレイを触れないでください。優しく配列の第2の電極の行に沿って背側縁を持つ配列に皮質を置きます。このように、発展途上浅層は最終的には配列のリマインダをカバーします。 VTAは皮質部の腹側の境界線（図1D）に隣接して配置されます。 キャップと緩くMEA /文化アセンブリは、プラズマ/トロンビン凝固を可能にするために、室温でフードの内側〜5分間座っている間、高湿度を維持するためにMEAのチャンバーを閉じます。さらに3文化4.3 – 一方、ステップ4.1を繰り返します。 慎重に25 × 5 / 8針で1 ccシリンジを用いて培養チャンバーに小さな液滴内の培養液600μlを加える。 しっかりとMEA室と場所MEA /インキュベーター（図1B）の内部ロッキングストレージトレイの文化のアセンブリを閉じます。に、3の手順をスピードアップ – 4のMEAは、重複する配列で組み立てることができます。 12多国間環境協定のための組立時間は<1時間でなければなりません。 in vitroでの 2日間（DIV）の後に、有糸分裂阻害剤10μlを加える。 4 DIVおよびその後4日毎でのリフレッシュの培地60％。 5。電気生理学的記録と刺激生成 MEAの各電極から〜10分の場合は24 kHzで約1週間5,6レコードが自発的な活動の後、ローカルフィールドポテンシャル（LFP）と活動電位を発生させるには神経細胞の傾向に大きなたわみとの関係を確立するには（ハードウェア：MEA1060 W /ブランキング回路、X1200ゲイン、12ビットA / D、範囲0から4096 mVの、マルチチャンネルシステム、ソフトウェア：MC_Rack）。グランドは内部接地電極を介して、または外部Ag / AgCl電極、半電池を追加して、提供されています。 細胞外スパイク活動から200 Hzの（バンドパス300 – – 3,000 Hz）の1のバンドパスフィルタでLFPを区切ります。スパイク活動は、さらにオフラインでスパイクの選別機（例えばPlexon社）を用いて、単一およびマルチユニット活動に分類することができます。スパイクは、各電極の平均値をトリガー計算する。皮質培養の場合は、最も平均値は、培養中のニューロンのスパイクの希望する時間として負のLFPのたわみ（nLFP）を識別します。 （図2）それぞれの電極にLFPのトレースからのノイズ（SD）の-3標準偏差の閾値を計算する、クロスしきい値（図2B、C）そのnLFPsのピーク時と振幅を決定する。時間ビンΔtの（2の間など- 8ミリ秒）を選択し、長さΔt（図2Dの連続したタイムbinesの同じ内にあるすべての電極からnLFPsを連結することによって、アレイ上の時空間nLFPクラスタを識別し、詳細については、2,4を参照してください、5）。 神経雪崩を識別するためには、各nLFPのクラスタのサイズを計算する、アクティブ電極またはnLFP振幅の合計の例数は、サイズのヒストグラムを構築し、二重対数座標にプロット。神経雪崩の場合は、サイズ分布は、二重対数座標2（図2E、F）の直線で近似べき乗則に従う。電源の法律上の統計的検定のための16を参照してください。 振幅Sと電流制御の刺激が（刺激発生器STG 1008、マルチチャンネルシステム）適用されるときに通過する電極を選択することにより、組織における誘発反応を引き出す。 – 200μA振幅は- Sで50μsの10の間の振幅+ S / 2とSで100μsの間に続く：電極の損傷を減らすために、限られた範囲、バイポーラ方形波形を持つ単一の衝撃の電荷中性の刺激を使用してください。詳細は取扱説明書を参照してください。 ダイナミックレンジ9録音するには、記録的な刺激は、刺激後500ミリ秒を、以下の全ての電極上に4 kHzのサンプリングレートでLFPの応答を記録した。刺激アーチファクトを低減し、プリアンプの飽和を防止するために刺激時のヘッドの段増幅器を切断するブランキング回路（マルチチャンネルシステム）を使用してください。 6。代表的な結果： 約8新しい多国間環境協定との – 9 10文化の何週間も存続します。私たちの長期的な録音のほとんどは、私たちは何週間のコース5を介して個々の文化の発展をフォローできるようにする培地で培養器の内部で行われる。我々の実験に基づいて、LFPの記録は確実に100以上の文化の日のために使用される多国間環境協定で得ることができる。対照的に、細胞外スパイク活動をより確実に、比較的新しい多国間環境協定（<40文化の日）で測定されます。典型的な実験では、我々は、培養容器は、密閉式保つ付属のヘッドステージ（図1B、左）とトレイに収納トレイ（図1B、右）からMEAを転送する。皮質5の、皮質- VTA共培養6、同様に麻酔をかけたラット6、in vivoで 7 の目を覚まし猿、浅層の神経雪崩時の神経発火のように、主にLFPのピーク陰性波に近い発生します（nLFP ）。従って、局所的に同期神経群の時空間の組織は、アレイ17上の空間と時間のnLFPsの発生を測定することによって推定することができます。 MEA上のアクティビティは、一時的なクラスタに出現する傾向がある、一方の電極ではそのようなその活動が他の部位の活動が付属しています。このような活動期間中のLFPの典型的な波形を離れて数秒を発生する3つのクラスタをプロット上で、図2Aに示されています。各クラスタの場合は、負のフィールドのたわみは、1秒のウィンドウ内でいくつかの電極で見ることができます。複数の負のSDの閾値を越えるnLFPピークを抽出する場合、nLFPピーク時の形での活動は、ドットの"列"は、様々な電極（図2B）で一致nLFPs近く表しているラスターに便利な可視化である。この活動の時間的空間的組織は、かなり複雑で、低時間分解能で多かれ少なかれ均一な表示"の列は"、、より高い時間分解能など（図2C）で別々のクラスタで構成されています。実際には、時空間nLFPクラスターの出現は非常に皮質ネットワークで構成されています。具体的には、組織は、神経雪崩のスケール不変です。これは、与えられた時間分解能Δtにおいてクラスタサイズの確率を計算することによって実証される。ここで、クラスタは、同じまたは連続した時間ビン（図2D）で発生するnLFPsで構成されています。このようなクラスタのサイズがクラスタごとにnLFPs、またはクラスタごとに統合されたnLFP振幅の合計数で表現されている場合、クラスタのサイズ分布は、その傾き-1.5 2,4,5,7であることが示されている電力の法則を、明らかに（図2E、F）。この分布はスケール不変kは定数因子であるKXS、にサイズsの比であるクラスタサイズの順序を識別する、秒から独立している-1.5 kは、であることに注意してくださいこのベキ法則の組織は、アレイ2の大きさ、時間分解能Δtの2、および重要なnLFPのたわみ7を識別するために使用するしきい値とは無関係です。神経グループサイズ7とnLFP振幅スケールは、nLFPsのスケール不変の組織はスケール不変、すなわちフラクタル、順序Oを反映しているので、fは局所的にすべてのサイズを含む神経細胞のグループを同期。 図1。マウントされているスレッドのガラスリングを持つMEA、および対応するキャップの（）側と上面図。 （B）インキュベーターのビューの中。左：インキュベーターの条件の下で、単一の培養液からの録音を可能にするヘッドマウント。右：培養増殖のために数々のMEAを保持するトレイ。側の車輪：培養増殖に必要な水中と大気にさらされたフェーズを交互にするためのモータ制御のロッキングデバイスのステッピング。皮質- VTA共培養に用いる冠状ラットスライス用（C）模式図。 VTA腹側被蓋領域（VTA、灰色）を含む皮質のセクション（左）と中脳のセクション（中央、右）は、破線に沿って切断することによって得られる。 CTX：皮質、WM：白質、CPU：線条体、VTA：橋：橋エリア。 15日までに、対応する冠状板8、18、および20を参照してください。 （D）の配置とMEAと文化の中で最初の9 DIV上に、その開発上の単一の皮質- VTAの共培養の成長。文化と、アレイ上で、その進歩的な拡大の平坦化に注意してください。反射組織部分では、変性細胞と壊死組織片を示す。健康な組織は、可視光で透視下で不透明と灰色です。 図2。皮質器官培養において神経雪崩。 （）配列での自発活動の三期間の重ねてプロットは、数秒で区切られています。各アクティビティの期間は、アレイ上に多数の電極にマイナスのLFPのたわみ（各色は、つのアクティビティの期間をラベル）で構成されていることに注意してください。 （B）の各電極からnLFPsの負のピーク時間は、活動のラスターに組み立てられます。 "Column'状の構造は、近くの同期活動の期間を示した。 （C）高度に一度のスケールで同期される列は、より高い時間的スケール（3時間スケールが示すように、）で複数の列で構成されていることに注意してください。神経雪崩のアルゴリズムの（D）模式図。ノイズのSD – xのしきい値を超える負のLFPのたわみ（nLFP）の2 × 2電極アレイのピークの時間と振幅で識別されます。 nLFPsの時間的空間的組織は、幅Δtの連続的アクティブタイムビンにクラスタ化されている。クラスタのサイズがnLFPと活性部位の数、すなわち電極のどちらかによって識別される（S = 4）、またはnLFP振幅の統合された和（S = 130μV）。寿命時間は、Δtの倍数で測定されます。クラスタのサイズ分布の（E、F）べき乗則は、神経雪崩のようにクラスタを識別します。配列（ここでは200μm）のためにΔdを特定の電極間距離の選択は、ダイナミクスが観察されるべきで、特定のΔtを紹介することに注意してください。具体的には、ΔD/Δtはべき乗則の傾きαがあるときの、ネットワーク内の平均伝播速度を近似した比率は、神経雪崩2,4,5に対して-1.5近似している。してくださいここをクリックして図2の拡大バージョンを参照すること。