Multi-array di elettrodi Recordings Valanghe neuronali in Culture organotipica

1. Sterile, Camera di vetro sigillabili con MEA per registrazioni a lungo termine Cilindri di vetro filettato con tappo in plastica-teflon (Asso di vetro), richiesti per la chiusura cultura sicuro e stretto da camera, vengono tagliate (Aceglass) circa 2 mm dal fondo del filetto (Fig. 1A, B). Anelli di vetro pulito da risciacquo con acqua (3x) e la bollitura per 5 minuti in 200 prove di alcol etilico, lasciare asciugare. Silicio soluzione aliquota tenuti ad allegare anelli di vetro alla superficie MEA. Mescolare 15 ml di parti A & B di Sylgard 184 Kit di silicone elastomero accuratamente, lasciare riposare per 15 minuti per eliminare le bolle d'aria, conservare in aliquote da 1 ml a -20 ° C. Colla anello di vetro alla MEA (griglia 8×8 w / elettrodo interno di terra, a 30 micron di diametro dell'elettrodo, 200/100 micron distanza inter-elettrodica di ratto / topo) (Fig. 1A, B). Raccogliere 1 ml di silicio (23 ° C) in siringa con ago piccolo calibro. Applicare del silicone di superficie di taglio grezzo di anello di vetro, vetro anello centrale su MEA, applicare un ulteriore strato di silicone intorno alla parte esterna del ring per una tenuta forte, lascia la cura per 1 – 2 ore a 60 ° C sulla piastra calda. Sterilizzare MEA da camera e tappi da camera in una cappa a flusso laminare da 3x risciacquo in acqua deionizzata seguita da alcool al 70% (3 x, per ultimo risciacquo lasciate riposare per 10 minuti in alcool), seguiti da 10 minuti di esposizione della camera e degli interni tappo ai raggi UV . MEA camera di autoclave (120 ° C; bagnato; min 45) e lasciare asciugare. Cappotto superficie MEA all'interno della camera cultura poli-D-lisina. Per i nuovi MEA, che sono piuttosto lipofile, cappotto da aspirazione goccia ripetuta della soluzione dalla griglia di elettrodi. Per MEA utilizzati, coperchio inferiore da camera con soluzione, aspirare il liquido in eccesso, far evaporare in condizioni di sterilità all'interno cappa laminare. Fissare tappo per sigillare MEA camera per la conservazione e l'uso futuro. 2. Ingredienti necessari per la preparazione e la crescita di culture organotipica Sciogliere agar sterile nello 0,9% di NaCl, versare in sterili Petri (Falcon, 100 x15; ~ 5 mm Livello), lasciate raffreddare e avvolgere sterile con Parafilm per la conservazione. Tagliare 20 x 10 x 5 mm da blocchi di agar solido per l'uso. Negozio super-colla, ad esempio Devcon Super Glue II, con la confezione pulito con 70% EtOH prima di aprire, all'interno della cappa a flusso laminare per preservare la sterilità. Preparare il 50% di D-glucosio (SIGMA ultra, G7528) con l'aggiunta di 40 g di glucosio per 40 ml di acqua deionizzata cultura (Sigma). Conservare in 2 ml a -20 ° C. Aggiungere 4 ml di 50% di D-glucosio a 500 ml di soluzione salina bilanciata Gey, e freddo per granite (miscela di liquido / cristalli di ghiaccio) in freezer prima dell'uso. Pollo al plasma ricostituire in 5 ml di acqua deionizzata cultura (scuotere gentile, evitare la formazione di bolle), per non accontentarsi di una soluzione 5 – 10 min, capovolgere delicatamente, e decantate il chiaro contenuto in una piastra di Petri sterile. Sterile-filtro (0,22 micron filtro pori; proteine) soluzione al plasma, aliquota 350 microlitri in cryotubes (NuncTM), conservare a -20 ° C. Trombina ricostituire da plasma bovino di conseguenza, sterile-filtro (0,22 micron pori del filtro), aliquota 40 microlitri in cryotubes (NuncTM), conservare a -20 ° C. Per la soluzione di lavoro, diluire 40 ml di soluzione di trombina in 375 ml di soluzione salina bilanciata Gey di w / D-glucosio. Preparare 400 ml di terreno di coltura mescolando 100 ml di siero di cavallo, 200 ml basale medio Aquila, 100 ml di Hank soluzione salina tamponata a cui si aggiungono 4 ml di glucosio al 50% e 2 ml di 200 mM L-glutammina. Può essere conservato 4 – 8 settimane in 100 ml bottiglie PYREX a 4 ° C. Preparare inibitore della mitosi, mescolando uridina 0,3 mM, 0,3 mm mm ARA-C citosina-β-D-arabinofuranoside, e 0,3 5-fluoro-2'-deossiuridina, filtro sterile, aliquota 200 ul e conservare a -20 ° C per 6 – 12 mesi. 3. Cortex e area tegmentale ventrale (VTA) dissezione tissutale (tempo: <1 ora) Procedura produce corteccia e sezioni di tessuto VTA per ~ 12 co-culture di ratti o topi, e viene preparato all'interno di una cappa a flusso laminare in condizioni sterili. Tempo totale per la raccolta di tessuto deve essere di 1 ora. Prendere sano, cuccioli ben nutriti (numero dei nati ~ 10; presenza di un 'spot latte' addominale) a 1 – 2 giorni dopo la nascita (PND). Tenere un cucciolo delicatamente il muso, lasciarlo pendere liberamente, e velocemente decapitare alla base del collo con le forbici taglienti. Per la rimozione del cervello, togliere la pelle (due tagli laterali forbice), taglio a forbice cranio aperto con gli occhi bene (1 sagittale taglio della linea mediana; 1 taglio coronale alla corteccia / giunzione cervelletto). Capovolgere di nuovo tutti e 4 i lembi cranio. Con una spatola affilata, tagliare frontalmente attraverso il bulbo olfattivo, spatola anticipo caudalmente sotto il cervello. Sollevare delicatamente il cervello fuori dal cranio e farla scivolare in sterili, refrigerati, Gey soluzione per un rapido raffreddamento e lo stoccaggio temporaneo. Ripetere i passaggi 3,2-3,3 per 2 cervelli più (tempo totale: <20 min). Per ottenere VTAtessuto, trasferire il cervello su una sterile, piatto asciutto Petri con una spatola di piccole dimensioni. Ulteriori rimuovere il liquido in eccesso facendo scorrere delicatamente ogni cervello di circa 1 cm di lato. Rimuovere tronco cerebrale da una corona, taglio verticale a livello del cervelletto con una lama di rasoio. Colla blocco agar per il montaggio disco per la stabilizzazione meccanica del cervello durante la procedura di taglio. Inserire una linea sottile di colla di qualche millimetro di fronte al blocco agar sul disco (evitare di toccare l'agar colla). Con una spatola piccola, trasferire e montare ogni cervello, polo frontale verso il basso. Assicurarsi che i poli frontali sono incollati al disco di montaggio e che le parti ventrali toccare la agar senza residui di colla in modo da ottenere la giusta stabilizzazione meccanica durante il taglio e facile decollo delle fette tagliate. Con attenzione immergere e sicuro disco di montaggio con montaggio cervello in un cassetto vibratome (es. Leica VT1000) pieno di sterile, refrigerati soluzione di Gey. Con una lametta accuratamente puliti (90% EtOH), tagliare fette coronali del mesencefalo a frequenza più alta vibrazione e relativamente bassa velocità di avanzamento in uno spessore di 400 500 micron. L'utilizzo di un invertito pipetta Pasteur con bulbo di aspirazione, il trasferimento e la raccolta contenente le fette VTA in 35 mm x 10 piatti pieni di Petri sterile, refrigerati soluzione Gey (Fig. 1C; vedere la targhetta anche coronale 18-20 a E22 a 15). Per le sezioni della corteccia, ripetere i passaggi 3,2-3,6, ma si applicano taglio verticale tra corteccia e cervelletto, e montare forebrains con polo frontale alto. Circa 3 fette coronali (350 micron di spessore) a partire a livello dello striato sono raccolti per la dissezione corteccia futuro. Utilizzando un micro-lama fatta di lame di rasoio rotto, sezionare ~ 2 mm di larghezza sezione coronale della corteccia frontale e delle aree del mesencefalo che contiene il VTA (Fig. 1C) sotto uno stereomicroscopio. Raccogliere separatamente sezioni di tessuto in piatti di piccole dimensioni (es.: vetrini da camera), contenente una soluzione di Gey refrigerata. 4. Montaggio Cortex e fette di tessuto VTA sul MEA (Time: <1 ora) Posizione MEA a temperatura ambiente al microscopio stereo con la matrice di elettrodi a fuoco. Centro a 25 gocce ml di plasma sul pulito, privo di polvere, e sterile matrice matrice di elettrodi. Utilizzando spatole piccolo, far scorrere con attenzione una corteccia e la sezione in VTA la goccia plasma. MEA posto sulla piastra di raffreddamento, rimettere a fuoco vista, lasciate raffreddare per circa 15 s, poi aggiungere 25 ml di trombina nel plasma goccia. Utilizzando la punta della pipetta trombina, con attenzione diffondere la plasma / trombina miscela con piccoli movimenti circolari in tutto il MEA. Non toccare l'array di elettrodi direttamente fragile. Delicatamente posizione della corteccia sull'array con bordo dorsale lungo la fila secondo elettrodo dell'array. In questo modo, gli strati superficiali sviluppo arriverà a coprire il richiamo della serie. Il VTA è messa vicino al confine ventrale della sezione corteccia (Fig. 1D). Cap e vagamente chiudere la camera di MEA per mantenere alto tasso di umidità, mentre il MEA / cultura montaggio si siede per ~ 5 minuti all'interno della cappa a temperatura ambiente per permettere al plasma / trombina coagulazione. Nel frattempo, ripetere il passaggio 4,1-4,3 per 3 culture più. Aggiungere con cautela 600 ml di terreno di coltura in piccole gocce alla camera di cultura con una siringa da 1 cc con 25 x 5 / 8 ago. Chiudere bene la camera e il luogo MEA MEA / montaggio cultura sul vassoio portaoggetti a dondolo all'interno dell'incubatore (Fig. 1B). Per accelerare la procedura, 3 – 4 MEA possono essere montati in sequenze che si sovrappongono. Tempo di montaggio per 12 MEA deve essere <1 ora. Dopo 2 giorni in vitro (DIV), aggiungere 10 ml di inibitore della mitosi. Aggiorna cultura dei media del 60% a 4 DIV e ogni 4 giorni successivi. 5. Registrazione elettrofisiologiche e generazione di stimolo Per stabilire la relazione tra deviazioni significative nelle potenzialità campo locale (LFP) e la tendenza dei neuroni a fuoco potenziali d'azione, dopo ~ 1 settimana 5,6 registrano l'attività spontanea a 24 kHz per circa 10 minuti da ogni elettrodo della MEA (Hardware : MEA1060 w / circuito di tranciatura, x1200 guadagno, 12 bit A / D, range 0-4096 mV, sistemi multicanale; Software: MC_Rack). Terreno è fornito attraverso l'elettrodo interno di terra, o esternamente aggiungendo un Ag / AgCl metà delle cellule. Separare le LFP con un filtro passa banda di 1 – 200 Hz da extracellulare attività picco (banda passante 300 – 3000 Hz). Spike attività possono essere ulteriormente classificati in attività singole e multi-unità utilizzando off-line selezionatrici picco (es. Plexon Inc.). Calcola il picco innescato medie per ogni elettrodo. Per le culture corteccia, la maggior parte medie identificherà negativo deviazioni LFP (nLFP) come momento privilegiato di spiking neuronale nella cultura. Calcolare per ogni elettrodo una soglia di -3 deviazioni standard del rumore (SD) dalle tracce LFP (Fig. 2), Determinare i tempi e le ampiezze di picco nLFPs che attraversano soglia (Fig. 2B, C). Ha scelto un tempo di bin At (ad esempio tra 2 – 8 ms) e identificare i cluster nLFP spazio-temporale sulla matrice concatenando nLFPs da tutto elettrodi che sono gli stessi del combina tempo successivi di At lunghezza (Fig. 2D; per i dettagli vedi 2,4 , 5). Al fine di individuare valanghe neuronale, calcolare la dimensione di ogni cluster nLFP, ad esempio il numero di elettrodi attivi o somma delle ampiezze nLFP, costruire un istogramma dimensioni, e la trama a doppio logaritmica coordinate. Per le valanghe neuronali, la distribuzione delle dimensioni segue una legge di potenza approssimata da una linea retta in doppio logaritmica coordinate 2 (Fig. 2E, F). Vedere 16 per test statistici sulle leggi di potenza. Suscitare risposte evocate nel tessuto selezionando un elettrodo attraverso il quale vengono applicati corrente controllato stimoli con ampiezza S (generatore di stimoli STG 1008, i sistemi multicanale). Per ridurre i danni elettrodo, utilizzare una gamma limitata, di carica neutra stimolazione di shock singola con bipolare piazza d'onda: 50 ms con ampiezza-S seguita da 100 ms con ampiezza + S / 2 e S tra le 10-200 μA. Consultare il manuale del proprietario per ulteriori dettagli. Per registrare la gamma dinamica 9, stimolo registrare registrate le risposte LFP a 4 kHz frequenza di campionamento su tutti gli elettrodi dopo 500 ms dopo la stimolazione. Usa tranciatura circuito (sistemi multi-canale), che stacca la testa amplificatori palco durante la stimolazione per ridurre gli artefatti stimolo e per evitare di pre-amplificatore saturazione. 6. Rappresentante dei risultati: Con i nuovi MEA circa 8 – 9 su 10 culture sopravvivere per molte settimane. La maggior parte dei nostri a lungo termine le registrazioni hanno luogo all'interno della incubatrice nel terreno di coltura, che ci permette di seguire lo sviluppo delle singole culture nel corso di molte settimane 5. Sulla base delle nostre esperienze, le registrazioni LFP può essere attendibilmente ottenuta con MEA utilizzato per più di 100 giorni della cultura. Al contrario, l'attività extracellulare picco è più attendibile relativamente nuovi MEA (<40 giorni cultura). In un tipico esperimento, abbiamo trasferire una MEA dal vassoio di memorizzazione (Fig. 1B, a destra) per il vassoio con la fase di testa allegata (Fig. 1B, a sinistra) tenere la camera di cultura sigillata. Per la corteccia 5, corteccia-VTA co-colture 6, così come nel ratto anestetizzato 6 e la scimmia sveglio in vivo 7, scarica neuronale durante valanghe neuronale negli strati superficiali avviene prevalentemente vicino alla deviazione di picco negativo della LFP (nLFP ). Così, l'organizzazione spazio-temporale dei gruppi neuronali sincronizzate a livello locale può essere valutata misurando la presenza di nLFPs nello spazio e nel tempo il 17 array. Attività sul MEA tende ad emergere in cluster temporale, in modo tale che l'attività di un elettrodo è accompagnato da attività in altri siti. Forme d'onda tipica della LFP durante i periodi di tale attività sono riportati in figura 2A, da oltre tracciando 3 gruppi che si verificano alcuni secondi di distanza. Per ogni cluster, deviazioni campo negativo può essere visto più elettrodi all'interno di una finestra di 1 s. Quando si estraggono i picchi nLFP che attraversano una soglia di più negativo SD, l'attività in forma di nLFP punta è comodamente visualizzata in un raster in cui 'colonne' di punti rappresentano vicino nLFPs coincidente a vari elettrodi (Fig. 2B). L'organizzazione spazio-temporale di questa attività è piuttosto complesso; 'colonne', che appaiono più o meno omogeneo a bassa risoluzione temporale, sono composte da cluster separati a più alta risoluzione temporale e così via (fig. 2C). Infatti, l'emergere di cluster spazio-temporale nLFP è altamente organizzati in reti corticali. Più specificamente, l'organizzazione è scale-invariante per le valanghe neuronale. Ciò è dimostrato calcolando la probabilità di dimensioni dei cluster in un dato At risoluzione temporale. Qui, i cluster sono costituiti da nLFPs che si verificano negli appositi contenitori contemporaneamente o successive (Fig. 2D). Quando la dimensione di tale cluster è espressa in numero totale di nLFPs per cluster, o integrato ampiezze nLFP per cluster, le distribuzioni dei cluster dimensioni rivela una legge di potenza, la cui pendenza ha dimostrato di essere -1,5 2,4,5,7 ( fig. 2E, F). Si noti che questa distribuzione identifica una scala-invariante ordinamento delle dimensioni dei cluster che è il rapporto tra dimensioni s per KXS, dove k è un fattore costante, è -1,5 k, che è indipendente da s. Questa organizzazione legge di potenza è indipendente dalle dimensioni della matrice 2, la risoluzione temporale At 2, e la soglia utilizzata per identificare nLFP significative deviazioni 7. Perché le scale ampiezza nLFP con dimensione del gruppo neuronale 7, la scala-invariante organizzazione di nLFPs riflette una scala-invariante, cioè frattale, ordinando of gruppi neuronali sincronizzate a livello locale che comprendono tutte le dimensioni. Figura 1. (A), viste laterali e parte superiore del MEA con ghiera filettata vetro montato, e il tappo corrispondente. (B) Vista interna del termostato. A sinistra: headstage montaggio che consenta la registrazione di una singola cultura in condizioni di incubatrice. A destra: Vassoio tenendo MEA numerosi per la crescita della cultura. Ruote laterali: motore passo-passo dispositivo controllato a dondolo per alternando fase sommerso e l'atmosfera esposti necessari per la crescita della cultura. (C) Schema per le fette di ratto coronale utilizzato per Cortex-VTA co-culture. Sezioni della corteccia (a sinistra) e le sezioni mesencefalo (al centro, a destra) contenente il VTA tegmentale ventrale (VTA, grigio) si ottengono tagliando lungo le linee tratteggiate. Ctx: corteccia; wm: sostanza bianca; cpu: striato; vta: pons: area pontina. Vedi anche piatti corrispondenti coronale 8, 18, ​​e 20 da 15. (D) collocamento e la crescita di una singola corteccia-VTA co-culture in MEA e il suo sviluppo nei primi 9 DIV nella cultura. Nota l'appiattimento della cultura e della sua progressiva espansione sulla matrice. Parti di tessuto riflettente indicare cellule degenerate e detriti dei tessuti. Tessuto sano è opaco e grigio con transilluminazione con la luce visibile. Figura 2. Valanghe neuronale corticale a culture organotipica. (A) Overplot di tre periodo di attività spontanea sulla matrice, separati da alcuni secondi. Si noti che ogni periodo di attività è costituito da deviazioni LFP negativo sulla elettrodi molti sul campo (ogni colore etichette un periodo di attività). (B) ore di punta negativa di nLFPs da ogni elettrodo sono assemblati in un raster di attività. 'Column'-come le strutture indicati i periodi di attività vicino a sincrono. (C) Si noti che le colonne che appaiono altamente sincronizzati in una scala di tempo costituito da più colonne alle scale temporali superiori (3 scale temporali in figura). (D) Rappresentazione schematica dell'algoritmo valanga neuronale. Su un 2 x 2 ore di punta serie di elettrodi e l'ampiezza delle deviazioni negative LFP (nLFP) attraversando una soglia di-x SD del rumore sono identificati. Organizzazione spazio-temporale di nLFPs è raggruppate in contenitori tempo successivamente attivo di At larghezza. La dimensione di un cluster è identificato sia dal numero di siti attivi, cioè con elettrodi nLFP (s = 4), o la somma integrata di ampiezze nLFP (s = 130 uV). Il tempo di vita si misura in multipli di At. (E, F) legge di potenza nella distribuzione dimensione cluster identifica i cluster come valanghe neuronale. Si noti che la scelta di una distanza interelettrodica particolare Δd per l'array (qui 200 micron) introduce una At particolare in cui la dinamica dovrebbe essere osservato. Più in particolare, il rapporto in cui Δd / At approssima la velocità media di propagazione in rete, in cui la α pendenza della legge di potenza è approssima -1,5 per valanghe neuronale 2,4,5. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande della figura 2.