تسجيلات صفيف متعدد القطب من الانهيارات الجليدية الخلايا العصبية في الثقافات عضوي النمط

1. العقيمة ، وغرفة الزجاج قابل للغلق مع شركة طيران الشرق الأوسط على المدى الطويل تسجيلات يتم قطع الزجاج اسطوانات مترابطة مع غطاء من البلاستيك تفلون (ايس زجاج) ، واللازمة لتأمين وضيق الثقافة إغلاق غرفة ، (Aceglass) حوالي 2 مم من أسفل الصفحات (الشكل 1A ، B). حلقات الزجاج النظيفة الشطف بالماء (3X) ويغلي لمدة 5 دقائق في 200 دليل ايثيل الكحول ، واسمحوا الجافة. قسامة حل السيليكون المطلوبة لنعلق على سطح الزجاج حلقات MEA. مزيج من 15 مل أجزاء A & B من 184 Sylgard كيت سيليكون إلاستومر بدقة ، واسمحوا الجلوس لمدة 15 دقيقة لإزالة فقاعات الهواء ، وتخزينها في aliquots مل 1 في -20 درجة مئوية. الغراء الزجاجي الدائري لشركة طيران الشرق الأوسط (8X8 الشبكة ث / الداخلية القطب الأرض ، وقطرها 30 ميكرومتر الكهربائي ، 200/100 ميكرومتر المسافة بين القطب عن الجرذان / الماوس) (الشكل 1A ، B). يستغرق 1 مل من السيليكون (23 درجة مئوية) في المحاقن مع إبرة قياس صغيرة. تنطبق على سطح سيليكون قطع الزجاج غير المصقول للحلقة ، ومركز للرنين الزجاج على الشرق الأوسط وأفريقيا ، وتطبيق طبقة إضافية من السليكون في أنحاء خارج الحلبة لتقوية الختم ، اسمحوا علاج لمدة 1 — 2 في ساعة ~ 60 درجة مئوية على صفيحة ساخنة. MEA تعقيم الغرفة وغرفة القبعات في التدفق الصفحي هود 3X شطف في الماء منزوع الأيونات تليها الكحول 70 ٪ (3 × ؛ للمشاركة شطف اسمحوا الجلوس لمدة 10 دقيقة في الكحول) ، تليها 10 دقيقة من التعرض للغرفة الداخلية والغطاء لضوء الأشعة فوق البنفسجية . الأوتوكلاف MEA غرفة (120 درجة مئوية ؛ الرطب ؛ 45 دقيقة) ، واسمحوا الجافة. معطف MEA السطح داخل الغرفة مع ثقافة بولي يسين – D. عن الاتفاقات الجديدة ، والتي هي محبة للدهون بدلا من ذلك ، معطف التي تطلع الحبرية المتكررة من الحل الكهربائي من الشبكة. لاستخدام الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف ، وتغطي قاع الغرفة مع الحل ، نضح السوائل الزائدة ، والسماح لتتبخر تحت ظروف معقمة داخل غطاء الصفحي. نعلق غطاء لاغلاق شركة طيران الشرق الأوسط غرفة للتخزين واستخدام في المستقبل. 2. المكونات اللازمة لإعداد ونمو عضوي النمط الثقافات حل آغار العقيمة في 0.9 ٪ كلوريد الصوديوم ، طبق بتري تصب العقيمة (فالكون ، 100 X15 ؛ ~ مستوى 5 مم) ، واسمحوا باردة ، والتفاف العقيمة مع Parafilm للتخزين. قطع 20 × 10 × 5 مم من كتل صلبة آغار للاستخدام. مسح تخزين فائقة الغراء ، على سبيل المثال المساعدة DevCon سوبر الغراء الثاني ، مع التعبئة والتغليف إلى أسفل مع EtOH 70 ٪ قبل الافتتاح ، داخل الصفحي غطاء للحفاظ على تدفق العقم. تجهيز 50 ٪ D – غلوكوز (SIGMA جدا ، G7528) وذلك بإضافة 40 غراما من السكر و 40 مل من الماء ثقافة غير المتأينة (سيغما). متجر في 2 مل في aliquots -20 درجة مئوية. إضافة 4 مل من 50 ٪ D – الجلوكوز إلى 500 مل من محلول ملح Gey والمتوازن ، والبرد لطين (خليط من السائل / بلورات الجليد) في الثلاجة قبل الاستخدام. إعادة البلازما الدجاج في 5 مل ماء ثقافة غير المتأينة (هزة لطيفة ، وتجنب نشوء الفقاعات) ، واسمحوا حل تسوية لمدة 5 — 10 دقيقة ، بلطف دوامة ، وdecantate مضمون واضح في طبق بتري معقمة. معقمة فلتر (0.22 ميكرون فلتر المسام ؛ البروتين) حل البلازما ، قسامة 350 ميكرولتر في cryotubes (NuncTM) ، في مخزن -20 درجة مئوية. ثرومبين إعادة البلازما من الأبقار وفقا لذلك ، معقمة فلتر (0.22 ميكرون فلتر المسام) ، قسامة 40 ميكرولتر في cryotubes (NuncTM) ، وتخزينها في -20 درجة مئوية. الحل للعمل ، 40 ميكرولتر من تمييع الحل ثرومبين في 375 ميكرو لتر من محلول ملح Gey متوازنة ث / D – الجلوكوز. تحضير 400 مل من مستنبت عن طريق خلط 100 مل من مصل الحصان ، 200 مل بصل النسر متوسطة ، و 100 مل من محلول ملحي هانك التخزين المؤقت والتي تضاف إليها 4 مل من الجلوكوز 50 ٪ و 2 مل من 200 ملي L – الجلوتامين. ويمكن تخزين 4 — 8 أسابيع في 100 مل الزجاجات PYREX في 4 درجات مئوية. إعداد المانع الانقسام عن طريق خلط يوريدين 0.3 مم ، 0.3 مم ARA – C – السيتوزين β – D – arabinofuranoside ، و 0.3 ملي – 5 – الفلوري 2' – deoxyuridine تصفية عقيمة ، قسامة ميكرولتر 200 وتخزينها في درجة مئوية لمدة 6 -20 — 12 شهرا. 3. القشرة وبطني السقيفية تشريح الأنسجة المنطقة (VTA) (الوقت : <1hr) الإجراء غلة القشرة والمقاطع للنسيج VTA ~ 12 الثقافات المشترك من الجرذان أو الفئران ، وأنها مستعدة داخل غطاء تدفق الصفحي تحت ظروف معقمة. وينبغي إجمالي الوقت لجمع الأنسجة يكون من 1 ساعة. تأخذ صحي ، تغذية جيدة الجراء (حجم القمامة ~ 10 ؛ جود "بقعة الحليب" في منطقة البطن) في 1-2 أيام بعد الولادة (PND). عقد الجرو بلطف الخطم ، والسماح لها بحرية معطلا ، وقطع رأس بسرعة عند قاعدة العنق مع مقص حاد. لإزالة الدماغ ، وإزالة الجلد (اثنان تخفيضات مقصية جانبية) ، وقطع الجمجمة مفتوحة مع مقص العين الجميلة (1 قطع خط الوسط sagital (1) ؛ خفض الاكليلية في القشرة / مفرق المخيخ). الوجه الخلفي جميع اللوحات الجمجمة 4. مع ملعقة شحذ ، وقطع طريق frontally البصلة الشمية ، ملعقة مسبقا caudally أسفل الدماغ. رفع بلطف الدماغ من الجمجمة ، والسماح لها الانزلاق أو مبردة Gey محلول معقم ، والتبريد السريع والتخزين المؤقت. كرر الخطوات 3،2-3،3 لأكثر العقول 2 (الوقت الإجمالي : <20 دقيقة). للحصول على VTAالأنسجة ، ونقل على أدمغة معقمة ، وطبق بيتري جافة باستخدام ملعقة صغيرة. إزالة مزيد من السوائل الزائدة عن طريق تحريك بلطف كل الدماغ حوالي 1 سم جانبيا. إزالة جذع الدماغ عن طريق القص ، الاكليلية عمودي على مستوى المخيخ باستخدام شفرة حلاقة. الغراء كتلة أغار على القرص متزايدة لتحقيق الاستقرار الميكانيكي للدماغ أثناء تشريح الداخلي. وضع خط رفيع من superglue بضعة ملليمترات أمام كتلة أغار على القرص (الغراء تجنب لمس آغار). باستخدام ملعقة صغيرة ونقل وتحميل كل المخ ، والقطب الجبهي لأسفل. ضمان أن يتم لصقها على القرص أقطاب الأمامية المتصاعدة والتي تلمس بطني الجانبين آغار دون أي بقايا الغراء من أجل تحقيق الاستقرار الميكانيكي السليم أثناء التقطيع ورفع سهل بعيدا عن قطع من شرائح. يغرق بعناية وتأمين القرص المتصاعد مع التجمع في الدماغ في علبة vibratome (مثل لايكا VT1000) مليئة العقيمة ، والحل في Gey مبردة. بشفرة حلاقة تنظيفها بعناية (90 ٪ EtOH) ، وقطع من شرائح الاكليلية في الدماغ المتوسط ​​أعلى تردد الاهتزاز إلى الأمام وسرعة منخفضة نسبيا في سمك 400 500 ميكرومتر. باستخدام ماصة باستير المقلوب مع لمبة الشفط ، ونقل وجمع شرائح تحتوي على VTA في 35 X 10 مم مملوءة أطباق بتري معقمة ، والحل في Gey المبردة (الشكل 1C ، وانظر أيضا لوحة الاكليلية 18-20 في E22 في 15). لأبواب القشرة ، كرر الخطوات من 3،2-3،6 ، ولكن تطبيق خفض الرأسي بين اللحاء والمخيخ ، وجبل forebrains مع القطب الجبهي تصل. وتجمع حوالي 3 شرائح الاكليلية (350 ميكرون سمك) ابتداء من مستوى المخطط للتشريح قشرة المستقبل. باستخدام سكين صغيرة مصنوعة من كسر شفرات الحلاقة ، تشريح ~ 2 مم الباب الاكليلية واسعة من القشرة الأمامية والمناطق التي تحتوي على الدماغ المتوسط ​​VTA (الشكل 1C) تحت stereomicroscope. جمع المقاطع الأنسجة بشكل منفصل في أطباق صغيرة (شرائح الغرفة مثلا) مملوءة بمحلول Gey مبردة ل. 4. تصاعد اللحاء وشرائح الأنسجة VTA على شركة طيران الشرق الأوسط (حسب التوقيت : <1 ساعة) موقف شركة طيران الشرق الأوسط في درجة حرارة الغرفة تحت المجهر ستيريو مع مجموعة الكهربائي في التركيز. مركز قطرة 25 ميكرولتر من البلازما على نظيفة ، خالية من الغبار ، ومعقمة مصفوفة مجموعة الكهربائي. باستخدام spatulae الصغيرة ، الشريحة بعناية لحاء والباب VTA في قطيرة البلازما. MEA مكان على لوحة التبريد ، وإعادة تركيز الرأي ، السماح ليالي البرد 15 ~ ، ثم إضافة 25 ميكرولتر من ثرومبين الحبرية في البلازما. استخدام غيض ثرومبين ماصة ، وانتشار الخليط بعناية البلازما / ثرومبين مع حركات دائرية صغيرة في جميع أنحاء الشرق الأوسط وأفريقيا. لا تلمس مجموعة هشة الكهربائي مباشرة. موقف القشرة بلطف على الحدود مع مجموعة الظهرية على طول صف القطب الثاني للمجموعة. بهذه الطريقة ، سوف تغطي طبقات سطحية النامية في نهاية المطاف تذكير من الصفيف. يتم وضع VTA المتاخمة للحدود بطني من المقطع القشرة (الشكل 1D). وأغلق غطاء فضفاض غرفة MEA للاحتفاظ ارتفاع نسبة الرطوبة في حين أن التجمع MEA / ثقافة يجلس لدقيقة 5 ~ داخل غطاء في درجة حرارة الغرفة للسماح للبلازما / ثرومبين التخثر. وفي الوقت نفسه ، كرر الخطوة 4،1-4،3 لمدة 3 أكثر الثقافات. إضافة بعناية 600 ميكرولتر من مستنبت في قطرات صغيرة لغرفة الثقافة باستخدام حقنة سم مكعب 1 مع 25 × 5 / 8 إبرة. إغلاق الغرفة بإحكام ، وشركة طيران الشرق الأوسط MEA المكان / جمعية الثقافة على علبة تخزين هزاز داخل الحاضنة (الشكل 1B). لتسريع الإجراء ، 3 — يمكن تجميعها 4 الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف في متواليات متداخلة. وينبغي أن الوقت التجميع لمدة 12 الاتفاقات تكون <1hr. بعد أيام في المختبر 2 (DIV) ، تضاف 10 ميكرولتر من مثبطات الانقسام. تحديث ثقافة الإعلام بنسبة 60 ٪ في 4 DIV وكل 4 أيام بعد ذلك. 5. تسجيل الكهربية وانشاء التحفيز لتحديد العلاقة بين الانحرافات الكبيرة في مجال المحتملة المحلي (LFP) وميل من الخلايا العصبية لاطلاق النار إمكانات العمل ، وبعد أسبوع النشاط ~ 1 الإجابات عفوية 5،6 في 24 كيلوهرتز لدقيقة 10 ~ من كل قطب من شركة طيران الشرق الأوسط (الأجهزة : MEA1060 ث / تقطيع الدوائر ، x1200 كسب ، 12 بت A / D ، مجموعة 0-4096 بالسيارات ، ونظم متعددة ؛ البرمجيات : MC_Rack). وتقدم الأرض إما عن طريق القطب الأرض الداخلية ، أو خارجيا عن طريق إضافة خلية حج / AgCl نصف. فصل LFP مع عصابة تمرير الترشيح من 1 — 200 هرتز من تصاعد النشاط خارج الخلية (تمرير الفرقة 300 — 3000 هرتز). يمكن أن يكون ارتفاع النشاط تصنيفها إلى مزيد من النشاط وحدة واحدة ومتعددة باستخدام خارج خط فارزات الارتفاع (على سبيل المثال شركة Plexon). أثار تصاعد حساب المعدلات لكل قطب. للثقافات القشرة ، فإن معظم المتوسطات تحديد الانحرافات السلبية LFP (nLFP) حيث أن الوقت المفضل لالتشويك العصبية في الثقافة. حساب لكل قطب عتبة الانحرافات المعيارية من الضوضاء -3 (SD) من آثار LFP (الشكل 2)، وتحديد أوقات الذروة وسعة من nLFPs التي تعبر عتبة (الشكل 2B ، C). اختار الوقت Δt بن (مثلا بين 2-8 مللي ثانية) ، وتحديد مجموعات nLFP spatiotemporal على الصفيف بواسطة concatenating nLFPs من جميع الكهربائي التي هي في نفس الوقت bines المتعاقبة Δt طول (الشكل 2D ؛ لمزيد من التفاصيل انظر 2،4 ، 5). من أجل تحديد الانهيارات العصبية ، وحساب حجم كل كتلة nLFP ، مثل عدد من الأقطاب الكهربائية النشطة أو مجموع سعة nLFP ، بناء المدرج حجمها ، والحبكة في المزدوج لوغاريتمي الإحداثيات. الانهيارات العصبية ل، وتوزيع حجم يتبع قانون السلطة يقترب من خط مستقيم في المزدوج لوغاريتمي إحداثيات 2 (الشكل 2E ، F). انظر 16 للاختبارات الإحصائية على قوانين السلطة. أثار حصول على ردود في الأنسجة من خلال تحديد إلكترود التي يتم من خلالها تطبيق الحالية التي تسيطر عليها مع المثيرات السعة S (مولد التحفيز STG 1008 ، نظم المتعددة). للحد من الضرر الكهربائي ، استخدم على نطاق محدود ورسوم التحفيز محايدة من الصدمات واحد مع القطبين مربع الموجي : 50 ميكرو ثانية مع السعة – S تليها 100 ميكرو ثانية مع S + السعة / 2 و S بين 1-20 أمبير. راجع دليل المالك لمزيد من التفاصيل. لتسجيل النطاق الديناميكي 9 ، سجلت ردود التحفيز سجل LFP في 4 كيلوهرتز معدل أخذ العينات في جميع أقطاب التالية 500 مللي ثانية بعد التحفيز. استخدام تقطيع الدوائر (متعدد القنوات النظم) الذي قطع مكبرات الصوت المرحلة الرأس خلال التحفيز للحد من القطع الأثرية والتحفيز لمنع ما قبل مكبر للصوت ، التشبع. 6. ممثل النتائج : مع الاتفاقات الجديدة حوالي 8 — سوف 9 من أصل 10 الثقافات البقاء على قيد الحياة لعدة أسابيع. معظم تسجيلات طويلة الأجل لدينا تجري داخل الحاضنة في وسط الثقافة ، والذي يتيح لنا متابعة تطور الثقافات الفردية على مدى 5 أسابيع عديدة. بناء على تجاربنا ، ويمكن الحصول على التسجيلات LFP موثوق مع الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف المستخدمة لأيام الثقافة أكثر من 100. في المقابل ، تصاعد النشاط خارج الخلية أكثر قياسها مع الاتفاقات الجديدة نسبيا (<أيام الثقافة 40). في تجربة نموذجية ، ونحن بتحويل الشرق الأوسط وأفريقيا من علبة التخزين (الشكل 1B ، يمين) في علبة مع المرحلة الرأس المرفقة (الشكل 1B ، يسار) الحفاظ على ثقافة غرفة مغلقة. لقشرة 5 ، القشرة ، VTA المشترك الثقافات 6 ، وكذلك في تخدير الفئران (6) والقرد مستيقظا في الجسم الحي 7 ، اطلاق العصبية خلال الانهيارات العصبية في الطبقات السطحية يحدث في الغالب قريبة من الانحراف السلبي ذروة LFP (nLFP ). وبالتالي ، يمكن تقدير المنظمة spatiotemporal الجماعات العصبية متزامنة محليا عن طريق قياس وقوع nLFPs في الفضاء والوقت على 17 مجموعة. النشاط في الشرق الأوسط وأفريقيا يميل إلى الظهور في مجموعات الزمنية ، ويرافق هذا النشاط مثل دفعة واحدة حسب النشاط الكهربائي في مواقع أخرى. وتظهر الموجات النموذجية للأندية خلال فترات نشاط من هذا القبيل في الشكل 2A ، بنسبة تزيد على 3 مجموعات بالتآمر حدوث عدة ثوان عن بعضها البعض. لكل كتلة ، يمكن أن ينظر الانحرافات السلبية في مجال أقطاب عديدة داخل إطار من 1 ثانية. عند استخراج قمم nLFP التي تتخطى عتبة SD سلبية متعددة ، والنشاط في شكل nLFP أوقات الذروة هو تصور ملائم في النقطية التي 'الأعمدة' بالقرب من النقاط تمثل في nLFPs تتزامن الأقطاب المختلفة (الشكل 2B). المنظمة spatiotemporal من هذا النشاط هو معقدة إلى حد ما ؛ وتتكون "أعمدة" ، والتي تبدو أكثر أو أقل تجانسا في القرار الزماني منخفضة ، مجموعات منفصلة في القرار الزماني أعلى وهكذا دواليك (الشكل 2C). في الواقع ، هو درجة عالية من التنظيم وظهور التكتلات nLFP spatiotemporal في الشبكات القشرية. بشكل أكثر تحديدا ، فإن المنظمة على نطاق ثابتة عن الانهيارات العصبية. ويتجلى هذا من خلال حساب الاحتمالات من أحجام الكتلة في Δt القرار الزمني المعطى. هنا ، وتتألف من مجموعات nLFPs التي تحدث في نفس الوقت أو صناديق المتتالية (الشكل 2D). عندما يتم التعبير عن حجم الكتلة من هذا القبيل في عدد nLFPs لكل كتلة ، أو متكاملة nLFP سعة لكل كتلة ، وتوزيع حجم الكتلة يكشف عن قانون السلطة ، الذي المنحدر وقد تبين أن 2،4،5،7 -1.5 ( الشكل 2E ، F). علما بأن هذا التوزيع يحدد ترتيب النطاق ثابتة من أحجام الكتلة التي هي نسبة ليالي الأحجام لkxs ، حيث k هو عامل ثابت ، هو ك -1،5 ، وهي مستقلة عن س. هذا التنظيم قانون السلطة مستقلة عن حجم الصفيف 2 ، القرار الزماني Δt 2 ، ويستخدم لتحديد عتبة nLFP كبيرة الانحرافات 7. لأن موازين السعة nLFP مع حجم المجموعة العصبية 7 ، المنظمة على النطاق ثابتة من nLFPs يعكس النطاق ثابتة ، أي كسورية ، س يأمرو تزامن محليا مجموعات الخلايا العصبية التي تشمل جميع الأحجام. الشكل 1 : (أ) منصة جانبية وكبار آراء MEA مع حلقة مترابطة الزجاج ، وقبعة ذات الصلة. (ب) في الداخل نظرا للحاضنة. اليسار : headstage جبل السماح لتسجيل من ثقافة واحدة تحت شرط الحاضنة. الحق : صينية عقد العديد من الاتفاقات لنمو الثقافة. عجلات الجانب : تكثيف رقابة الجهاز الحركي هزاز لمرحلة التناوب المغمورة والغلاف الجوي ، يتعرض اللازمة لنمو الثقافة. (C) الرسم التخطيطي للشرائح الإكليلية الفئران المستخدمة في القشرة ، VTA المشترك الثقافات. ويتم الحصول على قطع من قبل على طول خطوط مكسورة ؛ المقاطع القشرة (يسار) وأقسام الدماغ المتوسط ​​(وسط ، يمين) الذي يحتوي على VTA المنطقة الجوفية السقيفية (رمادي vta). CTX : القشرة ؛ WM : مادة بيضاء ؛ CPU : المخطط ؛ vta : الجسر : جسري المنطقة. انظر أيضا لوحات المناظر الاكليلية 8 ، 18 ، و 20 بنسبة 15. (د) التنسيب ونمو قشرة واحدة ، VTA الثقافات المشتركة في الشرق الأوسط وأفريقيا وتطورها على مدى 9 DIV الأولى في الثقافة. لاحظ تسطيح للثقافة والتوسع التدريجي في الصفيف. قطع نسيج الانعكاسية تشير الخلايا تحولت الأنسجة والحطام. الأنسجة السليمة وغير شفاف رمادي تحت تضوء مع الضوء المرئي. الشكل 2. الانهيارات العصبية في الثقافات عضوي النمط القشرية. (أ) من ثلاثة Overplot فترة من النشاط العفوي في الصفيف ، مفصولة عدة ثوان. علما بأن كل فترة النشاط يتكون من الانحرافات LFP سلبية على العديد من الأقطاب على مجموعة (كل لون التسميات فترة واحدة النشاط). (ب) يتم تجميعها أوقات الذروة السلبية nLFPs من كل قطب كهربائي في النقطية من النشاط. "وأشار Column' هياكل شبيهة فترات النشاط متزامن القريب. (C) لاحظ أن الأعمدة التي تظهر على نطاق واسع للغاية متزامنة مرة واحدة تتكون من عدة أعمدة في الجداول الزمنية للأعلى (3 جداول الزمنية معروضة). (د) تمثيل تخطيطي لخوارزمية الانهيار العصبي. على 2 × 2 وقت الذروة القطب مجموعة من الانحرافات والسعة LFP السلبية (nLFP) عبور عتبة X – SD من الضوضاء التي تم تحديدها. ويشترك في تنظيم Spatiotemporal nLFPs في صناديق الوقت نشط تباعا من Δt العرض. يتم تحديد حجم كتلة من قبل عدد من المواقع إما نشطة ، أي مع أقطاب nLFP (ق = 4) ، أو مجموع متكامل من سعة nLFP (ق = 130 μV). يقاس الوقت الحياة في مضاعفات Δt. (E ، F) قانون السلطة في توزيع حجم الكتلة يحدد الكتل الثلجية والعصبية. علما بأن اختيار مسافات معينة interelectrode Δd للصفيف (هنا 200 ميكرومتر) يقدم Δt سيما التي ينبغي مراعاتها لديناميات. بشكل أكثر تحديدا ، فإن نسبة التي Δd / Δt يقارب متوسط ​​سرعة الانتشار في الشبكة ، في المنحدر الذي α من قانون السلطة هو يقترب -1،5 لالانهيارات العصبية 2،4،5. الرجاء انقر هنا لرؤية نسخة أكبر من الشكل 2.