Multieletrodos Recordings Array of Avalanches Neuronal em culturas organotípicas

1. Estéril, com câmara de vidro Sealable MEA para gravações a longo prazo Cilindros de vidro com rosca e tampa de plástico com Teflon (Ace Glass), necessárias para o fechamento seguro e apertado cultura de câmara, são cortados (Aceglass) cerca de 2 mm da parte inferior do fio (Fig. 1A, B). Anéis de vidro limpo com agua (3x) e fervente por 5 min em 200 provas álcool etílico, deixe secar. Solução de silício alíquota obrigado a juntar anéis de vidro à superfície MEA. Misture 15 ml de peças de A & B de Sylgard Kit de elastômero de silicone 184 completamente, deixe descansar por 15 min para remover bolhas de ar, uma loja em alíquotas ml a -20 ° C. Cola anel de vidro para o MEA (8×8 grade w / eletrodo de aterramento interno, 30 diâmetro do eletrodo M, 200/100 M-eletrodo inter distância para rato / mouse) (Fig. 1A, B). Tome-se 1 ml de silicone (23 ° C) em seringa com agulha de calibre pequeno. Aplique silicone para superfície de corte do anel de vidro polido, anel de vidro no centro MEA, aplique uma camada adicional de silício em torno do exterior do anel de vedação para uma mais forte, vamos cura para 1-2 horas a ~ 60 ° C em chapa quente. Esterilizar MEA câmara e as tampas de câmara em uma capela de fluxo laminar por lavar 3x em água deionizada seguido pelo álcool a 70% (3 x; para o último enxágüe deixe descansar por 10 min em álcool), seguido de 10 min de exposição da câmara e tampa interior à luz UV . Autoclave MEA câmara (120 ° C; molhado; 45 min) e deixe secar. Revestimento de superfície MEA dentro da câmara de cultura com poli-D-lisina. MEAs para novas, que são bastante lipofílico, casaco por aspiração de gotículas repetidas da solução da grade do eletrodo. Para MEAs usado, tampa inferior da câmara com a solução, aspire o excesso de líquido, deixe evaporar sob condições estéreis dentro capô laminar. Anexar tampa para selar MEA câmara para armazenamento e uso futuro. 2. Ingredientes necessários para a preparação e Crescimento das Culturas organotípicas Dissolver ágar estéril em 0,9% NaCl, despeje em placa de Petri estéril (Falcon, 100 x15; ~ nível 5 mm), deixe esfriar e enrole estéril com Parafilm para armazenamento. Corte de 20 x 10 x 5 mm a partir de blocos de agar sólido para uso. Loja super cola, por exemplo, Devcon Super Glue II, com a embalagem varrida para baixo com EtOH 70% antes da abertura, dentro da capela de fluxo laminar para preservar a esterilidade. Prepare 50% D-Glicose (SIGMA ultra, G7528), adicionando 40 g de glicose a 40 ml de água desionizada cultura (Sigma). Armazenar em alíquotas de 2 ml a -20 ° C. Adicionar 4 ml de 50% D-glicose por 500 ml de solução salina balanceada de Gey, e frio de lama (mistura de líquido / cristais de gelo) no congelador antes de usar. Reconstituir plasma de frango em 5 ml de água da cultura de-ionizado (agitação suave, evitar a formação de bolhas), deixe a solução de se contentar com 5 – 10 min, rode suavemente, e decantate o conteúdo claro em uma placa de Petri estéril. Armazenar a solução plasma, 350 mL da alíquota em criotubos (NuncTM), a -20 ° C.; estéril-filtro (proteína 0,22 mM poros do filtro) Trombina reconstituir a partir de plasma bovino em conformidade, estéril-filtro (0,22 mM poros do filtro), alíquota de 40 mL em criotubos (NuncTM), armazenar a -20 ° C. Para trabalhar solução, diluir 40 mL da solução de trombina em 375 ml de solução salina balanceada de Gey w / D-Glicose. Prepare 400 ml de meio de cultura através da mistura de 100 ml de soro de cavalo, 200 ml Basal Medium Eagle, 100 ml da solução de Hank Buffered Saline a que 4 ml de glicose 50% e 2 ml de 200 mM L-glutamina são adicionados. Podem ser armazenados 4-8 semanas, em frascos de 100 ml PYREX a 4 ° C. Prepare inibidor da mitose através da mistura de 0,3 mM uridina, 0,3 mM mM ARA-C citosina-β-D-arabinofuranoside e 0.3 5-fluoro-2'-deoxiuridina, filtro estéril, 200 mL da alíquota e armazenar a -20 ° C por 6 – 12 meses. 3. Córtex e área tegmental ventral dissecção dos tecidos (VTA) (hora: <1h) Procedimento de rendimentos córtex e cortes de tecidos VTA para ~ 12 co-culturas de ratos ou camundongos, e está preparado dentro de uma capela de fluxo laminar em condições estéreis. Tempo total de coleta de tecido deve ser de 1 hr. Tome geraram filhotes saudáveis ​​e bem nutridos (tamanho da leitegada ~ 10; presença de um 'spot de leite abdominal) em 1-2 dias pós-natal (PND). Segure um filhote de cachorro gentilmente pelo focinho, deixe-o solto, e rapidamente decapitar na base do pescoço com uma tesoura afiada. Para a remoção do cérebro, remover a pele (dois laterais cortes de tesoura), cortar o crânio aberto com tesoura olho fino (1 sagital corte da linha média; um corte coronal no córtex / junção cerebelo). Back flip todos os 4 flaps crânio. Com uma espátula afiada, corte frontal através do bulbo olfatório, espátula antecedência caudalmente debaixo do cérebro. Levante cuidadosamente o cérebro fora do crânio e deixá-lo deslizar para dentro estéril, refrigerado, Gey solução para resfriamento rápido e armazenamento temporário. Repita o 3.2 Passos para 3,3 para 2 cérebros mais (tempo total: <20 min). Para obter VTAtecidos, transferência de cérebros em uma placa de Petri estéril, seca com uma espátula pequena. Continuar a suprimir o excesso de fluido, deslizando cada cérebro cerca de 1 cm de lado. Remover tronco cerebral por um corte, coronal vertical ao nível do cerebelo usando uma lâmina de barbear. Bloco de agar Glue para a montagem do disco para a estabilização mecânica do cérebro durante o corte procedimento. Coloque uma linha fina de superglue alguns milímetros à frente do bloco de ágar no disco (evitar tocar a cola agar). Usando uma pequena espátula, transferir e montar cada cérebro, pólo frontal para baixo. Assegurar que os pólos frontais são colados ao disco de montagem e que os lados ventral tocar o agar sem resíduos de cola, a fim de alcançar a estabilização mecânica adequada durante o corte e fácil levantar-off de fatias de corte. Cuidadosamente submergir e disco montagem segura com a montagem do cérebro em uma bandeja vibratome (por exemplo, Leica VT1000) cheias de estéril, solução Gey de refrigerados. Com uma lâmina de barbear cuidadosamente limpos (90% EtOH), cortar fatias coronal do mesencéfalo na freqüência mais alta vibração e relativamente baixa velocidade de avanço com uma espessura de 400 500 mm. Usando uma pipeta Pasteur invertido com bomba de sucção, transferência e recolher fatias contendo o VTA em 35 x 10 milímetros pratos cheios de Petri estéril, solução Gey de refrigerados (Fig. 1C; ver placa também coronal 18-20 em E22 em 15). Para seções córtex, repita os passos de 3,2-3,6, mas aplicar corte vertical entre o córtex eo cerebelo, e montar prosencéfalo com pole frontal para cima. Cerca de 3 cortes coronais (350 espessura mm) começando no nível do corpo estriado são coletados para dissecção córtex futuro. Usando uma faca feita de micro-lâminas de barbear quebrado, dissecar ~ 2 mm de largura seção coronal do córtex frontal e áreas do mesencéfalo contendo o VTA (Fig. 1C), sob um estereomicroscópio. Coletar secções de tecido separadamente em pratos pequenos (por exemplo, slides câmara) preenchidas com solução de Gey refrigerados. 4. Montagem Cortex e fatias de tecido VTA no MEA (Time: <1 h) Posição MEA em temperatura ambiente sob um microscópio estéreo com o arranjo de eletrodos em foco. Centro de uma gota de 25 mL de plasma no limpo, livre de poeira, e matricial estéril eletrodo. Usando espátulas pequenas, deslize cuidadosamente um córtex e seção VTA na gota de plasma. MEA lugar na placa de refrigeração, reorientar vista, deixe esfriar para ~ 15 s, em seguida, adicione 25 mL da trombina para a gota de plasma. Usando a trombina ponta da pipeta, cuidadosamente espalhar a mistura de plasma / trombina com pequenos movimentos circulares por todo o MEA. Não toque no conjunto de eletrodos diretamente quebradiços. Suavemente a posição do córtex sobre a matriz com margem dorsal ao longo da fileira segundo eletrodo da matriz. Desta forma, as camadas superficiais desenvolvimento acabará por cobrir o lembrete da matriz. O VTA é colocado adjacente à fronteira ventral da seção córtex (Figura 1D). Cap e vagamente fechar a câmara de MEA para reter umidade elevada, enquanto a assembléia MEA / cultura fica por ~ 5 min dentro do capô à temperatura ambiente para permitir plasma / trombina coagulação. Enquanto isso, repita o passo 4,1-4,3 por 3 culturas mais. Juntar cuidadosamente 600 mL de meio de cultura em pequenas gotas para a câmara de cultura usando uma seringa de 1 cc com 25 x 08/05 agulha. Firmemente fechar a câmara de MEA e coloque MEA / montagem cultura na bandeja de armazenamento de balanço dentro da incubadora (Fig. 1B). Para acelerar o procedimento, 3-4 MEAs pode ser montado em seqüências que se sobrepõem. Tempo de montagem por 12 MEAs deve ser <1hr. Depois de dois dias in vitro (DIV), adicione 10 ml de inibidor de mitose. Atualizar cultura da mídia em 60% em 4 DIV ea cada 4 dias depois. 5. Gravação eletrofisiológicos e Geração de estímulo Para estabelecer a relação entre deflexões significativas no potencial de campo local (LFP) ea tendência de neurônios para disparar potenciais de ação, depois de gravar a atividade ~ 1 semana espontânea 5,6 a 24 kHz para ~ 10 minutos de cada eletrodo da MEA (Hardware : MEA1060 w / circuito de corte, o ganho x1200, 12 bit A / D, faixa de 0-4096 mV, sistemas multicanais; Software: MC_Rack). Terra é fornecido através do eletrodo de aterramento interno ou externamente, adicionando uma célula Ag / AgCl-metade. Separar os LFP com um filtro passa-banda de 1 – 200 Hz pico da atividade extracelular (passa-banda 300 – 3000 Hz). Atividade de pico pode ser classificada em atividade única e multi-unidade, utilizando classificadores off-line pico (por exemplo, Plexon Inc.). Calcule pico provocou médias para cada eletrodo. Para as culturas do córtex, a maioria médias irá identificar desvios negativos LFP (nLFP) como o momento preferido de spiking neuronal na cultura. Calcular para cada eletrodo um limiar de -3 desvios-padrão do ruído (SD) a partir de vestígios LFP (Fig. 2), Determinar os horários de pico e amplitudes de nLFPs que cruzam limiar (Fig. 2B, C). Escolheu um tempo Dt bin (por exemplo, entre 2-8 ms) e identificar surtos nLFP espaço-temporal da matriz concatenando nLFPs de todos os eletrodos que estão no mesmo tempo combina sucessivas de Dt comprimento (Fig. 2D; para mais detalhes veja 2,4 , 5). A fim de identificar avalanches neuronal, calcular o tamanho de cada cluster nLFP, por exemplo, número de eletrodos ativos ou soma de nLFP amplitudes, construir um histograma tamanho e parcela em duas vezes logarítmica coordenadas. Para avalanches neuronal, a distribuição de tamanho segue uma lei de potência aproximada por uma linha reta em coordenadas logarítmicas double-2 (Fig. 2E, F). Ver 16 para os testes estatísticos sobre as leis de potência. Eliciar respostas evocadas no tecido, selecionando um eletrodo através do qual a corrente controlada estímulos com amplitude S são aplicados (gerador de estímulo STG 1008, Sistemas Multicanal). Para reduzir os danos eletrodo, use um alcance limitado, carga neutra estimulação de choques único com bipolar onda quadrada: 50 mS com amplitude-S seguido de 100 mS com amplitude + S / 2 e S entre 1-20 mA. Consulte o manual do proprietário para obter mais detalhes. Para gravar a faixa dinâmica, 9 de estímulo recorde registrado respostas LFP em 4 kHz taxa de amostragem em todos os eletrodos seguintes 500 ms após a estimulação. Use blanking circuito (Multi-channel de sistemas) que desliga os amplificadores de palco cabeça durante a estimulação para reduzir artefatos de estímulo e evitar a saturação pré-amplificador. 6. Resultados representativos: Com MEAs novo aproximadamente 8 – 9 de 10 culturas irão sobreviver por muitas semanas. A maioria dos nossos longo prazo gravações ocorrem no interior da incubadora no meio de cultura, o que nos permite acompanhar o desenvolvimento das culturas individuais ao longo de muitas semanas 5. Com base em nossas experiências, as gravações podem ser confiavelmente LFP obtidos com MEAs usado por mais de 100 dias da cultura. Em contraste, a atividade pico extracelular é mais confiável medida com MEAs relativamente novos (<40 dias de cultura). Em um experimento típico, nós transferimos uma MEA da bandeja de armazenamento (Figura 1B, direita) para a bandeja com o estágio de cabeça em anexo (Figura 1B, à esquerda) mantendo a câmara de cultura selado. Para o córtex 5, córtex-VTA co-culturas 6, bem como no rato anestesiado 6 eo macaco acordado in vivo 7, disparo neuronal durante avalanches neuronal nas camadas superficiais ocorre predominantemente perto da deflexão pico negativo da LFP (nLFP ). Assim, a organização espaço-temporal de grupos neuronais sincronizados localmente pode ser estimada medindo-se a ocorrência de nLFPs no espaço e no tempo nos 17 matriz. Atividade no MEA tende a emergir em clusters temporal, tal atividade que, em um eletrodo é acompanhada por atividade em outros locais. Formas de onda típico da LFP durante os períodos de tal atividade são mostrados na Figura 2A, por mais de plotagem 3 clusters ocorrendo vários segundos de intervalo. Para cada cluster, deflexões campo negativo pode ser visto em vários eletrodos dentro de uma janela de 1 s. Ao extrair picos nLFP que cruzam um limite de múltiplos SD negativo, a atividade na forma de nLFP horário de pico está convenientemente visualizada em um raster em que "colunas" de pontos representam perto nLFPs coincidentes em vários eletrodos (Fig. 2B). A organização espaço-temporal desta actividade é bastante complexo; "colunas", que aparecem mais ou menos homogêneo em baixa resolução temporal, são compostas de grupos separados com maior resolução temporal e assim por diante (Fig. 2C). Na verdade, a emergência de clusters nLFP espaço-temporal é altamente organizados em redes cortical. Mais especificamente, a organização é escala-invariante de avalanches neuronal. Isto é demonstrado através do cálculo da probabilidade de tamanhos de cluster em um Dt determinada resolução temporal. Aqui, clusters são compostas de nLFPs que ocorrem nas caixas mesmo tempo ou sucessivos (Fig. 2D). Quando o tamanho de tal um cluster é expressa em número total de nLFPs por cluster, ou nLFP amplitudes integrada por cluster, as distribuições de tamanho do cluster revela uma lei de potência, cuja inclinação foi mostrado para ser 2,4,5,7 -1,5 ( fig. 2E, F). Note-se que esta distribuição identifica uma ordenação escala-invariante de tamanhos de cluster que é a relação de tamanhos para kxs s, onde k é um fator constante, é k -1,5, que é independente de s. Esta organização lei de potência é independente do tamanho da matriz 2, a resolução temporal Dt 2, eo limiar usado para identificar desvios significativos nLFP 7. Como as escalas amplitude nLFP com o tamanho do grupo neuronal 7, a organização em escala invariante de nLFPs reflete uma escala-invariante, ou seja, fractal, o ordenamentof localmente sincronizado grupos neuronais que incluem todos os tamanhos. Figura 1. (A) e superior Side pontos de vista do MEA com anel de vidro com rosca montado, e tampa correspondente. (B) Vista do interior da incubadora. Esquerda: headstage montagem permitindo a gravação de uma única cultura em incubadora. Direita: Bandeja segurando MEAs numerosos para o crescimento da cultura. Rodas laterais: pisar dispositivo motor controlado de balanço para alternando fase submersa e-atmosfera expostos necessários para o crescimento da cultura. (C) Desenho esquemático para as fatias de rato usado para coronal córtex-VTA co-culturas. Seções Cortex (esquerda) e seções mesencéfalo (médio, direito), contendo a área tegmental ventral VTA (VTA; cinza) são obtidos através do corte ao longo das linhas quebradas. Ctx: córtex; ui: substância branca; cpu: striatum; VTA: pons: área pontina. Veja também correspondente placas coronal 8, 18, ​​e 20 por 15. (D) Colocação e crescimento de uma única córtex-VTA co-culturas no MEA e seu desenvolvimento ao longo dos nove primeiros DIV cultura. Observe o achatamento da cultura e da sua expansão progressiva da matriz. Peças de tecido refletivo indicam células degeneradas e restos de tecido. Tecido saudável é opaco e acinzentado num transiluminador com luz visível. Figura 2. Avalanches Neuronal na cortical culturas organotípicas. (A) Overplot de três período de atividade espontânea na matriz, separados por alguns segundos. Note-se que cada período de atividade consiste em deflexões LFP negativo sobre vários eletrodos no array (cada cor rótulos um período de atividade). (B) os horários de pico negativo de nLFPs de cada eletrodo são montados em um raster de atividade. "Column' estruturas semelhantes indicado períodos de atividade síncrona próximo. (C) Note que as colunas que parecem altamente sincronizados em uma escala de tempo consistem de várias colunas nas escalas maior temporal (3 escalas temporais mostrado). (D) representação esquemática do algoritmo avalanche neuronal. Em um tempo de 2 2 x eletrodo pico variedade e amplitude de desvios negativos LFP (nLFP) cruzar um limite de x-SD do ruído são identificados. Organização espaço-temporal de nLFPs é agrupada em caixas de tempo sucessivamente ativa de Dt largura. O tamanho de um cluster é identificado por tanto o número de sítios ativos, ou seja, com eletrodos nLFP (s = 4), ou a soma integrada de nLFP amplitudes (s = 130 mV). O tempo de vida é medida em múltiplos de Dt. (E, F) a lei de energia na distribuição de tamanho de cluster identifica clusters como avalanches neuronal. Note-se que a escolha de um determinado distâncias intereletrodos Δd para a matriz (aqui 200 mm) introduz uma Dt específico em que a dinâmica deve ser observada. Mais especificamente, a relação em que Δd / Dt se aproxima da velocidade de propagação média na rede, em que a inclinação α da lei de potência é aproxima -1,5 por avalanches neuronal 2,4,5. Por favor, clique aqui para ver uma versão ampliada da figura 2.