Fluorescentie Lifetime Imaging voor Moleculaire Rotoren in levende cellen

De protocollen voor FLIM monstervoorbereiding niet verschillen van die voor confocale of wide-field intensiteit op basis van fluorescentie microscopie. De data acquisitie wordt gevolgd door de voornaamste taak van data-analyse, dat wil zeggen het extraheren van de fluorescentie levensduur van de ruwe data. Zodra deze zijn verkregen, data-interpretatie helpt om na te gaan of vervalsen hypothesen. 1. Aangekleurde cellen met moleculaire rotors Bereid een stock oplossing (10 ml) door het oplossen ongeveer 1 mg / ml van de kleurstof in een geschikt oplosmiddel (bijv. methanol BODIPY-C12) 6,7 met een nauwkeurige balans en een pipet. De cellen (model kankercellijn, HeLa in geval) gebeitst worden gekweekt op een plaat met een multiwell coverslide onderzijde van microscopie in een incubator bij 37 ° C met 5% CO2 atmosfeer tot ongeveer 80% confluent . Voeg 10 tot 20 ul van de stockoplossing van de levende cellen groeien in een multi-WELl plaat (SmartSlide 50 micro-incubatie systeem WaferGen) in 4 ml Opti-MEM medium (Gibco) per putje van een 6-wells plaat. Dit levert een micro-molaire kleurstof concentratie in de put. Breng de multi-wells plaat met een incubator bij 37 ° C met 5% CO2 atmosfeer 10-45 minuten voor kleuring. Verwijder de multiwell plaat uit de incubator en was de cellen 3-4 keer met 4 ml optisch heldere celkweek medium (bijv. Opti-MEM) naar overtollige kleurstof te verwijderen. Breng de plaat meerdere venstertjes aan de microscoop podium en sluit met een temperatuurregelaar / 5% CO 2-gas inlaat zoals vereist, in voorbereiding voor de beeldvorming. 2. FLIM van fluorescerende moleculaire rotors in cellen Plaats het monster op de microscoop podium en het verkrijgen van een transmissie-en fluorescentie afbeelding om fluorescerende cellen te identificeren. Een schematisch diagram van de experimentele opstelling is weergegeven in Fig. 1.Verify dat de fluorescentie komt voort uit de locaties ervaCTED (bijv. celmembraan, cytoplasma). Neem een ​​fluorescentie-emissie spectrum en controleren of deze is dat de kleurstof of eiwit verwacht, in dit geval het spectrum van de moleculaire rotor. Als negatieve controle beeld niet gekleurd monster controleren dat niet fluoresceren. Hoewel deze stap is niet noodzakelijk specifiek voor FLIM, het is een goede gewoonte in het algemeen en helpt om te controleren of de steekproef is wat je denkt dat het is. Schakel over naar FLIM mode – dit is eenvoudig te realiseren door het verplaatsen van een spiegel uit de fluorescentie detectie stralengang ("externe detector" knop op "stralengang instelling" paneel aan de Leica TCS SP2 overname besturingssoftware). Een passende fluorescentie-emissie-filter voor een spannende licht van het bereiken van de melder te blokkeren moet in de fluorescentie detectie beampath. Figuur 1. Experimentele regeling voor tijd-domein FLIM gebruikmakend van wisselstroomonfocal laser scanning microscoop. Scan het monster en te controleren, op de computer regelen van de FLIM overname, dat de detector telsnelheid (zwarte balk het label CFD bij overname besturingssoftware van de Becker & Hickl SPC 830 bord) is niet meer dan ongeveer 1% van de laser herhalingsfrequentie ( groene balk het label SYNC overname besturingssoftware). Als het, verlaag dan de laser excitatie-intensiteit, bijvoorbeeld door het plaatsen van een neutrale dichtheid filter in de laserstraal pad, om te voorkomen dat het verzamelen van pile-up vervormde fluorescentie verval bochten. Het verwerven van een FLIM beeld, typisch voor 3-5 minuten, stop scannen en besparen zij de ruwe gegevens (een 3D-data "kubus", bestaande uit ruimtelijke coördinaten x en y, en tijd). Open de ruwe gegevens in de fluorescentie verval analyse software pakket, bv TRI-2 14 of commerciële software, om de fluorescentie-intensiteit beeld weer te geven. Dit is gewoon de geïntegreerde fluorescentie verval, dat wil zeggen het gebied onder de fluorescentie verval curve, in elkepixel. Selecteer een typisch pixel door het plaatsen van de cursor er op en inspecteer de fluorescentie verval in die pixel. Als de piek telling onder de 100, gebruik maken van ruimtelijke binning van pixels. De tellingen van aangrenzende pixels (bijvoorbeeld 3×3 of 5×5) toegevoegd in de centrale pixel, zodat een hogere maximale aantal verkrijgt men. Dit levert een hogere statistische nauwkeurigheid voor de volgende stap. Als alternatief kan de meting herhaald voor een langere acquisitietijd (stap 5). Voor de 30-50min, is een ongeveer 10 maal hogere piek count (en totale tellingen) verkregen, maar dit is veel te lang een overname voor de meeste biologische monsters vanwege het gevaar van de invoering van artefacten als gevolg van steekproef beweging, microscoop drift, fototoxiciteit en fotobleken. Selecteer een globale pixel drempelwaarde (waarboven het verval in een pixel wordt gemonteerd) en een keer met een exponentiële verval fit op de afbeelding. Het resultaat levert een fluorescentie levensduur voor elke pixel dan de drempelwaarde, die vervolgens wordt gecodeerdkleur. Elke pixel is gekleurd met het resultaat van de pasvorm en FLIM kaart wordt verkregen. Controleer de verminderde chi-kwadraat-waarden voor verschillende pixels – ongeveer 1 (en tot 1,3) geeft een goede pasvorm. Inspecteer de bijbehorende restmaterialen, die willekeurig verdeeld moeten worden rond de nul. De fluorescentie levensduur histogram plots hoe vaak bepaalde fluorescentie levens optreden ten opzichte van de fluorescentie levensduur zelf. Stel het kleurbereik zodanig dat de fluorescentie levensduurverdeling past in het kleurbereik. Als monoexponential fit levert geen chi-kwadraat van ongeveer 1 (en tot 1,3) en er een systematische afwijkingen van de residuen van nul, is een meer geavanceerde model nodig. Bijvoorbeeld proberen aanbrengen van een dubbele exponentiële model om de fluorescentie vervalt, in verband twee verschillende omgevingen de sonde kan inch De aanpassing tevens de pre-exponentiële factoren of amplitudes die een indicatie van de relatieve hoeveelheid kleurstof geven een opbrengst milieument of het ander. Als alternatief kan een gestrekte exponentiële functie geschikt om te corrigeren voor een verdeling van fluorescentie levensduur. De resultaten voor de fluorescentie levensduur, pre-exponentiële factoren en de levensduur verhouding en de pre-exponentiële factor verhouding per pixel kan dan worden gecodeerd in kleur. Elke pixel is gekleurd volgens haar waarde, en het contrast als gevolg van fluorescentie levens, pre-exponentiële factoren en hun ratio's wordt verkregen. Wederom, zie de gereduceerde chi-kwadraat waarden (die ook kan worden gecodeerd in kleur en weergegeven als een afbeelding) – rond 1 (en tot en met 1.3) geeft een goede pasvorm. Controleer de residuen die willekeurig te verdelen rond nul. Fluorescentielevensduur histogrammen moet vergezeld gaan van alle beelden voor eenvoudige visualisatie van de gemiddelde fluorescentie levensduur waarden, en de fluorescentie levensduur distributie. 3. Representatieve resultaten Fluorescentie vervalt gemeten voorde fluorescerende moleculaire rotor bij toenemende viscositeit in methanol / glycerol mengsels zijn weergegeven in Fig. 2. De fluorescentie vervalt zijn monoexponential en de fluorescentie levenstijd varieert aanzienlijk als functie van de viscositeit. Het stijgt van ongeveer 300 ps in methanol (viscositeit 0,6 cP) naar 3,4 ns in 95% glycerol (viscositeit 950 cP). Figuur 2. Fluorescentievervaltijd profielen BODIPY-C 12 methanol / glycerol mengsels van verschillende viscositeit. 6 De logaritmische ijkcurve van fluorescentie levensduur τ versus viscositeit η de fluorescerende moleculaire rotor is weergegeven in Fig. 3. Het is een rechte lijn zoals gevraagd door de Förster Hoffman vergelijking 9 waarbij k 0 de radiative snelheidsconstante en z en x constanten, met 0 <x <1. Van logaritme weerszijden opbrengsten waarbij x de helling van de rechte lijn. Figuur 3. Een perceel van log fluorescentie levensduur versus log viscositeit voor BODIPY-C 12 levert een rechte lijn in overeenstemming met de Förster-Hoffmann vergelijking 6. Na de incubatie van levende cellen met de fluorescerende moleculaire rotor een punctata kleurstof verdeling wordt waargenomen in de fluorescentie beelden. FLIM beelden van HeLa-cellen geïncubeerd met een meso-gesubstitueerde BODIPY kleurstof worden getoond in Fig. 4. De fluorescentie vervalt in elke pixel van het beeld voldoende kan worden uitgerust met een enkele exponentiële verval model. <p class="jove_content"> Figuur 4. (A) fluorescentie-intensiteit en (b) FLIM beelden van HeLa cellen gekleurd met BODIPY-C 12. De lichte, puntlaesies regio's vertonen een kortere levensduur dan andere regio's. Deze kortere liftime overeen met een lagere viscositeit in het puncta waarschijnlijk vetdruppels volgens de Förster-Hoffmann vergelijking. Getrokken waarbij de levensduur uit elke pixel, verkrijgt men een fluorescentie levensduur histogram van het gehele beeld zoals getoond in Fig. 5. Figuur 5. Histogrammen van fluorescentie levensduur van FLIM beelden van HeLa-cellen gekleurd met meso-gesubstitueerde BODIPY moleculaire rotoren.