مضان التصوير عمر الدوار الجزيئية في الخلايا الحية
Summary
وقد برزت مضان التصوير العمر (فليم) كأسلوب رئيسي لصورة البيئة وتفاعل بروتينات معينة، والأصباغ في الخلايا الحية. فليم من الدوارات الجزيئية فلوري يسمح رسم الخرائط من اللزوجة في الخلايا الحية.
Abstract
نشر في كثير من الأحيان مهمة تحديد معدل خطوة في التفاعلات الكيميائية أو العمليات البيولوجية، ويلعب دورا في طائفة واسعة من الأحداث داخل الخلية. اللزوجة هي واحدة من المعالم الرئيسية التي تؤثر على انتشار الجزيئات والبروتينات، وارتبطت التغيرات في اللزوجة للمرض وخلل على المستوى الخلوي. 1-3 في حين أن وسائل متطورة لقياس اللزوجة السائبة، والتصوير microviscosity لا يزال يشكل تحديا . خرائط من الكائنات المجهرية اللزوجة، مثل الخلايا واحدة، لديها حتى وقت قريب يصعب الحصول عليها. اللزوجة رسم الخرائط مع تقنيات مضان هو مفيد لأنه، على غرار التقنيات البصرية الأخرى، فمن مينيملي، غير مدمرة، ويمكن تطبيقها على الخلايا الحية والأنسجة.
الدوارات الجزيئية فلوري يحمل عمر مضان والغلة الكم التي هي وظيفة من لزوجة المكروية بهم. التواء أو 4،5 ضمجزيئي عامل ضمن الجزيئتناوب يؤدي إلى عدم الاضمحلال الإشعاعي من الخلف الحالة المثارة إلى الحالة الأرضية. إن وجود بيئة لزجة تبطئ هذا التناوب أو التواء، وتقييد الوصول إلى هذا المسار الاضمحلال غير الإشعاعي. وهذا يؤدي إلى زيادة في الغلة الكم مضان وعمر مضان. مضان التصوير العمر (فليم) من تعديل الأصباغ BODIPY مسعور أن تكون بمثابة المحرك الجزيئي فلوري تبين أن عمر مضان من هذه التحقيقات هي وظيفة من microviscosity من بيئتهم. 6-8 مؤامرة لوغاريتمي من عمر مضان مقابل عوائد اللزوجة مذيب خط مستقيم أن يطيع المعادلة هوفمان فورستر. 9 هذه المؤامرة أيضا بمثابة معايرة الرسم البياني لتحويل حياة مضان في اللزوجة.
بعد حضانة الخلايا الحية مع الدوار تعديل BODIPY الجزيئية فلوري، ويلاحظ توزيع صبغ منقط في الصور مضان. قيمة اللزوجة التي تم الحصول عليها في اله نقاط وفي الخلايا الحية هي في حدود 100 مرة أعلى من المياه ومن السيتوبلازم الخلوي. 6،7 الوقت لحلها القياسات تباين مضان تسفر مرات ارتباط التناوب في اتفاق مع هذه القيم microviscosity كبير. تعيين عمر مضان مستقلة عن كثافة مضان، ويسمح بالتالي فصل تركيز التحقيق والآثار اللزوجة.
في ملخص، وضعنا نهجا عمليا وتنوعا لتعيين microviscosity في الخلايا استنادا فليم من الدوارات الجزيئية فلوري.
Protocol
Discussion
فليم يقدم بعض المزايا الرئيسية على مدى شدة القائم على التصوير مضان. يمكن أن يقدم تقريرا عن أحداث photophysical أن من الصعب أو المستحيل لمراقبة من قبل التصوير كثافة مضان، لأنه لا يمكن فصلها عن التأثيرات تركيز fluorophore. هذا مفيد جدا لرسم خرائط لزوجة داخل الخلايا بواسطة الدوارات التصوير الجزيئي فلوري. ويمكن بسهولة عمر مضان أن تتحول إلى اللزوجة باستخدام الرسم البياني معايرة، كما هو مبين في الشكل. 3، ومستقلة عن تركيز الدوارات الجزيئية فلوري.
في فليم قد تكون هناك القطع الأثرية التي يمكن أن تعقد تفسير البيانات. 10 التحف الآلي وتشمل الضوء المتناثرة والتي ستظهر باعتبارها ذروة على رأس بداية الاضمحلال مضان، ويجوز الخلط بينه وبين زمن الاضمحلال قصير، أو ذروة صغيرة بعد الحرية الدينية الدولية والتي قد تكون ناجمة عن انعكاسات داخل المجهر. يمكن التعرف على هذه التحف الضوء المتناثرة على هذا النحولأنه لا يمكن تمييزها مع التمييز الطيفية – هم دائما على نفس الموجة مثل ضوء مثيرة. نتذكر أن في الهواء، وعلى ضوء يسافر 30 سم في 1 النانوسيكند تساعد على تحديد الأصل من الأفكار.
ويمكن تصفية أو مضان زجاج تسبب أيضا قطعة أثرية، لا سيما في مضان عينة منخفض، ولكن يمكن بسهولة تحديد هذا عن طريق أخذ عينة من دون قياس: إذا تم الحصول على الاضمحلال في ظل هذه الظروف، فإن ذلك يرجع إلى وثيقة وليس له اي علاقة مع عينة! من ناحية أخرى، نلاحظ أن تألق ذاتي عينة يمكن أن تسهم أيضا إلى الاضمحلال مضان.
في الوقت مترابطة العد فوتون واحد (TCSPC)، الوقت للوصول الى سعة المحول (TAC) يجوز لغير linearities يسبب نوبات الفقراء، ولكن يمكن تحديدها من خلال منع الإثارة وتسليط الضوء، على سبيل المثال المحيطة من مصدر الضوء ينتقل على العينة وقياس توقيت. وينبغي أن تكون خلفية ثابتةتم الحصول عليها في كل بكسل من الصورة. والمناطق التي يكون فيها الانحراف عن خلفية ثابت يحدث، وتستسلم أبدا مناسبا، وينبغي تجنبها للقياس إذا لا يمكن القضاء عليها عن طريق ضبط المعلمات من أجل بطاقة TCSPC.
واحد القطع الأثرية الشهيرة في TCSPC هو الفوتون كومة المتابعة والذي كان سببه أيضا ارتفاع معدل كشف الفوتون. 11،12 وهذا يؤدي إلى الفوتون الأول فقط يجري توقيتها، وتجاهل أي الفوتونات لاحقة، لأن الإلكترونيات هي توقيت مشغول وتجهيز الفوتون الأول. كومة المتابعة يؤدي الى تقصير عمر مضان، وأفضل طريقة لتجنب هذا هو الحفاظ على معدل العد فوتون في حوالي 1٪ من معدل تكرار ليزر.
توقعات
وهناك تطبيقات مختلفة من فليم، واعتمادا على التطبيق، كل له مزاياه وعيوبه. (13) مجهر مضان المثالي والحصول على كامل متعدد الأبعاد مضان emissioن من كفاف، شدة الموقف، والطول الموجي، مدى الحياة، والاستقطاب في قياس واحد، مع حساسية فوتون واحد، القرار المكانية القصوى والدنيا وقت الشراء. لا يوجد حاليا أي تكنولوجيا مع هذا مزيج فريد من السمات، وإلى بناء واحد لا يزال يشكل تحديا لمطوري الأجهزة. تطبيق تقنيات جديدة لمشاكل مادية هامة في بيولوجيا الخلية وغالبا ما يكون الطريق إلى اكتشافات غير متوقعة، وهناك طريق طويل يتعين قطعه قبل ونحن على مقربة من تشبع قدرات التصوير مضان لبيولوجيا الخلية. في الواقع، والتصوير المعلمات مضان مثل العمر، والطيف، والاستقطاب، فضلا عن التصوير بسرعة أكبر في 3D في أعلى المكاني القرار، من المؤكد أن تكشف عن جوانب جديدة في بيولوجيا الخلايا.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
مخك بفضل الهندسة في المملكة المتحدة، والعلوم الفيزيائية مجلس البحوث (EPSRC) واجهة برنامج علوم الحياة لزمالة الشخصية. ونود أيضا أن نعترف التمويل بواسطة التكنولوجيا الحيوية في المملكة المتحدة، والعلوم البيولوجية في مجلس البحوث (BBSRC).
Materials
Sample with fluorescent molecular rotors
Hardware:
inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope
Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources
Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP
cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors
DCC 100 detector control module
Software:
TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl
References
- Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: Volume, viscosity. diffusion, intracellular surface area. International Review of Cytology – a Survey of Cell Biology. , 192-1189 (2000).
- Stutts, M. J., Canessa, C. M., Olsen, J. C., Hamrick, M., Cohn, J. A., Rossier, B. C., Boucher, R. C. CFTR as a CAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269, 847-850 (1995).
- Dondorp, A. M., Angus, B. J., Hardeman, M. R., Chotivanich, K. T., Silamut, K., Ruangveerayuth, R., Kager, P. A., White, N. J., Vreeken, J. Prognostic significance of reduced red blood cell deformability in severe falciparum malaria. Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 507-511 (1997).
- Haidekker, M. A., Nipper, M., Mustafic, A., Lichlyter, D., Dakanali, M., Theodorakis, E. A., Demchenko, A. P. . Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology I. Fundamentals and Molecular Design. 8, 267-308 (2010).
- Haidekker, M. A., Theodorakis, E. A. Environment-sensitive behavior of fluorescent molecular rotors. J. Biol. Eng. 4, (2010).
- Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. Molecular Rotor Measures Viscosity of Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging. Journal of the American Chemical Society. 130, 6672-6673 (2008).
- Levitt, J. A., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Chung, P. H., Suhling, K., Phillips, D. Membrane-Bound Molecular Rotors Measure Viscosity in Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging. Journal of Physical Chemistry C. 113, 11634-11642 (2009).
- Hungerford, G., Allison, A., McLoskey, D., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Suhling, K. Monitoring Sol-to-Gel Transitions via Fluorescence Lifetime Determination Using Viscosity Sensitive Fluorescent Probes. J. Phys. Chem. B. 113, 12067-12074 (2009).
- Förster, T., Hoffmann, G. Die Viskositätsabhängigkeit der Fluoreszenzquantenausbeuten einiger Farbstoffsysteme. Zeitschrift für Physikalische Chemie Neue Folge. 75, 63-76 (1971).
- vandeVen, M., Ameloot, M., Valeur, B., Boens, N. L. Pitfalls and Their Remedies in Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy and Microscopy. J. Fluores. 15, 377-413 (2005).
- Becker, W. . Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques. , (2005).
- O’Connor, D. V., Phillips, D. . Time-correlated single-photon counting. , (1984).
- Suhling, K., French, P. M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochem. Photobiol. Sci. 4, 13-22 (2005).
- Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J., Carlin, L. M., Keppler, M. D., Ng, T. C., Vojnovic, B. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society – Interface. 6, S93-S105 (2009).
