Yaşayan Hücreler Moleküler Rotorlar arasında Flüoresans Ömrü Görüntüleme
Summary
Flüoresans Ömrü Görüntüleme (flim) görüntü ortamı ve spesifik proteinlerin ve canlı hücreler boyaların etkileşimi önemli bir teknik olarak ortaya çıkmıştır. Floresan moleküler rotor flim canlı hücreler viskozitenin haritalama sağlar.
Abstract
Difüzyon genellikle kimyasal tepkimeler veya biyolojik proseslerle önemli bir oran-belirleyen bir adım ve intraselüler olaylar, geniş bir aralıktaki bir rol oynar. Viskozite moleküllerin ve proteinlerin difüzyon etkileyen temel parametrelerden biridir, ve viskozite değişiklikleri hücresel düzeyde hastalık ve arıza bağlantılı olmuştur. 1-3 toplu viskozitesini ölçmek için yöntemler de geliştirilmiş olmakla birlikte, görüntüleme microviscosity bir sorun olmaya devam . Son zamanlarda elde etmek zor oldu kadar bu tek hücre gibi mikroskobik nesnelerin Viskozite haritalar, var. Diğer optik teknikler benzer, bu tahribatsız, minimal invaziv ve canlı hücrelere ve dokulara uygulanabilir, çünkü floresans teknikleri ile Haritalama viskozite avantajlıdır.
Floresan moleküler rotorlar floresans süreleri ve bunların mikroçevresinin viskozitesi bir fonksiyonu vardır kuantum verimleri sergilerler. 4,5 Moleküliçi büküm veyaDönme uyarılmış duruma geri asıl durumuna olmayan radyatif sönümü yol açar. Bir viskoz ortam bu ışıksız çürümesine yol erişimi kısıtlayarak, bu rotasyon veya büküm yavaşlatır. Bu floresans kuantum verimi ve floresans ömrü bir artışa yol açar. Floresan moleküler rotor olarak hareket değiştirilmiş hidrofobik BODIPY boyaların Flüoresans Ömrü Görüntüleme (flim) bu prob floresans yaşam ortamlarının microviscosity bir fonksiyonu olduğunu gösteriyor. 6-8 çözücü viskozitesi verimi karşı floresans ömrü bir logaritmik grafikte Förster Hoffman denklemi itaat düz bir çizgi. 9 Bu komplo da viskozite içine floresans ömrü dönüştürmek için bir kalibrasyon grafiği olarak hizmet vermektedir.
Modifiye BODIPY floresan moleküler rotor ile yaşayan hücrelerin inkübasyonu takiben, noktasal boya dağıtım floresans görüntüleri görülmektedir. Th elde viskozite değericanlı hücrelerde e punktumlarda yaklaşık 100 kez su daha yüksek olduğu ve hücresel sitoplazmaya taşır. 6,7 Zaman bağımlı floresans anizotropi ölçümler bu büyük microviscosity değerleri ile uyum içinde dönme korelasyon kat verim. Floresans ömrü eşleyerek floresans yoğunluğunu bağımsızdır ve böylece prob konsantrasyonu ve viskozite etkileri ayırma sağlar.
Özet olarak, floresan moleküler rotorların flim dayalı hücrelerinde microviscosity eşlemek için pratik ve çok yönlü bir yaklaşım geliştirdik.
Protocol
Discussion
Flim yoğunluğu tabanlı floresan görüntüleme üzerinden bazı önemli avantajlar sunuyor. Bu fluorofor konsantrasyon etkileri onları ayırabilirsiniz, çünkü floresan görüntüleme ile gözlemlemek zor veya imkansızdır fotofiziksel olayları rapor edebilirsiniz. Bu görüntüleme flüoresan moleküler rotorlar tarafından intraselüler viskozitesi haritalanması için özellikle yararlıdır. Şek floresans boyunca kolaylıkla, bir kalibrasyon grafiği kullanılarak bir viskoziteye dönüştürülebilir. 3, floresan moleküler rotorların konsantrasyonu bağımsızdır.
Flim verileri yorumlamayı güçleştirebilir eserler olabilir. 10 Enstrümantal eserler floresans çürüme başlangıcı üstüne bir zirve olarak görünecek ve kısa bir yıkım zamanı ile karışabilir saçılan ışık, ya sonra küçük bir tepe vardır IRF hangi mikroskop içindeki yansımaları neden olabilir. Bu dağınık ışık eserler gibi tespit edilebilironlar spektral ayrımcılık ile ayırt edilebilir çünkü – onlar heyecan verici ışık ile aynı dalga boyunda her zaman vardır. Hava, ışık 1 nanosaniye 30 cm seyahat eden Hatırlama yansımaları kökeni kesin olarak belirlemek için yardımcı olur.
Filtre veya cam floresan de özellikle düşük örnek floresans at, bir dışlayıcı neden olabilir, ancak bu kolay örnek olmadan bir ölçü alınarak tespit edilebilir: Bir çürüme, bu koşullar altında elde edilir, eğer araç nedeniyle ve hiçbir ilgisi yoktur Örnek ile! Diğer taraftan, örnek otofloresans da floresan çürümesine neden olabileceğini unutmayın.
Zaman ilişkili tek foton sayımında (TCSPC), süre-genlik çevirici (TAC) Lineer olmayan yoksul nöbete neden olabilir, ancak uyarma engelleme ve örnek üzerine iletilen ışık kaynağından örneğin ortam ışığı, parlayan tarafından tespit edilebilir ve zamanlaması ölçülmesi. Sabit bir arka olmalıdırgörüntünün her pikseline elde edilen. Sabit bir arka plan sapmalar meydana Bölgeler, iyi bir uyum verim asla ve TCSPC kartı parametrelerini ayarlayarak önlenememesi durumunda ölçüm için kaçınılmalıdır.
TCSPC biri rezil artifact çok yüksek bir foton yakalama oranı neden olan kazık-up fotondur. 11,12 Bu elektronik zamanlama meşgul olduğu için herhangi bir sonraki fotonlar yok sayarak ve ilk foton işleme, zamanlanmış olan sadece ilk foton yol açar. Floresans ömrü bir kısalma, ve bunu önlemek için en iyi yolu, Pile-up uçları lazer tekrarlama oranı yaklaşık% 1'ini de foton sayısı oranı tutmaktır.
Görünüm
Uygulamaya bağlı olarak, var flim çeşitli uygulamaları vardır ve her biri kendi avantajları ve dezavantajları vardır. 13 ideal bir floresan mikroskop sahip olacağı tüm boyutlu floresans emissiotek foton hassasiyet, maksimum uzamsal çözünürlük ve minimum alma süresi ile tek bir ölçüm yoğunluğu, konum, kullanım ömrü, dalga boyu ve polarizasyon, n kontur. Orada özellikleri bu eşsiz kombinasyonu ile hiçbir teknoloji şu anda, ve bir inşa etmek enstrümantasyon geliştiriciler için bir sorun olmaya devam etmektedir. Hücre biyolojisinde önemli sorunlara yeni fiziksel tekniklerin uygulanması çoğu zaman beklenmeyen buluşları yolu olduğunu ve hücre biyolojisi için floresans görüntüleme doyurarak yetenekleri yakın olan önce gitmek için uzun bir yol var. Aslında, böyle ömür boyu, spektrum ve polarizasyon gibi yüksek uzaysal çözünürlükte 3D daha hızlı görüntüleme gibi görüntüleme floresan parametrelerini, hücre biyolojisinde yeni yönlerini açığa kesindir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MKK Birleşik Krallık'ın Mühendislik ve kişisel Bursu için Fiziksel Bilimler Araştırma Konseyi (EPSRC) Yaşam Bilimleri Arayüz programı sayesinde. Ayrıca Birleşik Krallık'ın Biyoteknoloji ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC) tarafından finansman kabul etmek istiyorum.
Materials
Sample with fluorescent molecular rotors
Hardware:
inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope
Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources
Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP
cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors
DCC 100 detector control module
Software:
TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl
References
- Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: Volume, viscosity. diffusion, intracellular surface area. International Review of Cytology – a Survey of Cell Biology. , 192-1189 (2000).
- Stutts, M. J., Canessa, C. M., Olsen, J. C., Hamrick, M., Cohn, J. A., Rossier, B. C., Boucher, R. C. CFTR as a CAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269, 847-850 (1995).
- Dondorp, A. M., Angus, B. J., Hardeman, M. R., Chotivanich, K. T., Silamut, K., Ruangveerayuth, R., Kager, P. A., White, N. J., Vreeken, J. Prognostic significance of reduced red blood cell deformability in severe falciparum malaria. Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 507-511 (1997).
- Haidekker, M. A., Nipper, M., Mustafic, A., Lichlyter, D., Dakanali, M., Theodorakis, E. A., Demchenko, A. P. . Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology I. Fundamentals and Molecular Design. 8, 267-308 (2010).
- Haidekker, M. A., Theodorakis, E. A. Environment-sensitive behavior of fluorescent molecular rotors. J. Biol. Eng. 4, (2010).
- Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. Molecular Rotor Measures Viscosity of Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging. Journal of the American Chemical Society. 130, 6672-6673 (2008).
- Levitt, J. A., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Chung, P. H., Suhling, K., Phillips, D. Membrane-Bound Molecular Rotors Measure Viscosity in Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging. Journal of Physical Chemistry C. 113, 11634-11642 (2009).
- Hungerford, G., Allison, A., McLoskey, D., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Suhling, K. Monitoring Sol-to-Gel Transitions via Fluorescence Lifetime Determination Using Viscosity Sensitive Fluorescent Probes. J. Phys. Chem. B. 113, 12067-12074 (2009).
- Förster, T., Hoffmann, G. Die Viskositätsabhängigkeit der Fluoreszenzquantenausbeuten einiger Farbstoffsysteme. Zeitschrift für Physikalische Chemie Neue Folge. 75, 63-76 (1971).
- vandeVen, M., Ameloot, M., Valeur, B., Boens, N. L. Pitfalls and Their Remedies in Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy and Microscopy. J. Fluores. 15, 377-413 (2005).
- Becker, W. . Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques. , (2005).
- O’Connor, D. V., Phillips, D. . Time-correlated single-photon counting. , (1984).
- Suhling, K., French, P. M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochem. Photobiol. Sci. 4, 13-22 (2005).
- Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J., Carlin, L. M., Keppler, M. D., Ng, T. C., Vojnovic, B. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society – Interface. 6, S93-S105 (2009).
