חיים דימות פלואורסצנטי של הרוטורים מולקולרית בתאים חיים
Summary
דימות פלואורסצנטי חיים (FLIM) התפתחה הטכניקה מפתח לתמונה הסביבה ואינטראקציה של חלבונים ספציפיים צבעים בתאים חיים. FLIM של רוטורים מולקולאריים ניאון מאפשר מיפוי של צמיגות בתאים חיים.
Abstract
דיפוזיה הוא לעתים קרובות צעד חשוב בקביעת שיעור-בתגובות כימיות או תהליכים ביולוגיים משחק תפקיד במגוון רחב של אירועים תאיים. צמיגות היא אחד הפרמטרים העיקריים המשפיעים על דיפוזיה של מולקולות וחלבונים, ושינויים צמיגות נקשרו מחלות תקלה ברמה התאית. 1-3 בעוד שיטות כדי למדוד את הצמיגות בתפזורת מפותחים היטב, microviscosity הדמיה עדיין מהווה אתגר . מפות הצמיגות של עצמים מיקרוסקופיים, כגון תאים בודדים, יש עד לאחרונה קשה להשיג. צמיגות עם טכניקות מיפוי הקרינה יש יתרון משום, בדומה שיטות אופטיות אחרות, פולשנית, בלתי הרסניות והוא יכול להיות מיושם על תאים חיים ורקמות.
רוטורים מולקולאריים פלורסנט התערוכה חיים הקרינה ותשואות הקוונטים שהם פונקציה של הצמיגות של microenvironment שלהם. פיתול Intramolecular 4,5 אוסיבוב מוביל ריקבון לא מקרינים מאחור המדינה מתרגשת למצב בשטח. הסביבה צמיג מאט זה סיבוב או פיתול, הגבלת הגישה מסלול לא מקרינים את זה ריקבון. זה מוביל לעלייה בתשואה הקוונטים הקרינה ואת החיים פלואורסצנטי. דימות פלואורסצנטי חיים (FLIM) שונה של צבעים BODIPY הידרופובי אשר פועלים רוטורים מולקולאריים ניאון מראים כי החיים הקרינה של בדיקות אלה הוא פונקציה של microviscosity של סביבתם. 6-8 העלילה לוגריתמי של פעם בחיים הקרינה לעומת התשואות צמיגות ממס קו ישר, כי מציית המשוואה הופמן פורסטר. 9 עלילה זו משמשת גם גרף כיול להמיר בחיים הקרינה לתוך צמיגות.
לאחר דגירה של תאים חיים עם רוטור שונה BODIPY ניאון מולקולרית, הפצה צבע punctate הוא ציין את התמונות פלואורסצנטי. ערך צמיגות המתקבלות הדואר puncta בתאים חיים הוא כ 100 פעמים גבוה יותר מזה של מים בציטופלסמה של התא. 6,7 זמן נפתרה מדידות הקרינה אנאיזוטרופיה להניב פעמים מתאם הסיבוב בקנה אחד עם ערכים אלו microviscosity גדולים. מיפוי החיים הקרינה אינה תלויה בעוצמת הקרינה, ובכך מאפשר הפרדת ריכוז בדיקה ואפקטים צמיגות.
לסיכום, פיתחנו גישה מעשית צדדי למפות microviscosity בתאים מבוסס על FLIM של רוטורים מולקולאריים ניאון.
Protocol
Discussion
FLIM מציע כמה יתרונות מרכזיים על פני הדמיה עוצמה המבוסס על הקרינה. הוא יכול לדווח על אירועים photophysical שקשה או בלתי אפשרי לשמור על ידי הדמיה עוצמת הקרינה, כי זה יכול להפריד ביניהם מתופעות ריכוז fluorophore. תכונה זו שימושית במיוחד עבור מיפוי צמיגות תאיים על ידי רוטורים הדמיה מולקולרית ניאון. החיים הקרינה יכול בקלות להפוך צמיגות באמצעות גרף הכיול, כפי שמוצג באיור. 3, ללא תלות בריכוז של רוטורים מולקולאריים ניאון.
ב FLIM ייתכנו ממצאים עלול לסבך פרשנות הנתונים. 10 פריטים אינסטרומנטלי כולל אור מפוזר אשר יופיע בתור שיא על גבי תחילת הדעיכה הקרינה ועלול לבלבל עם זמן דעיכה קצר, או שיא קטן אחרי IRF, אשר עלולה להיגרם על ידי השתקפויות בתוך המיקרוסקופ. כלים אלו אור מפוזר ניתן לזהות ככזהכי הם יכולים להבחין באפליה רפאים – הם תמיד באורך גל זהה לזה של אור מרגש. לזכור באוויר, אור נוסע 30 ס"מ ב 1 שבריר שנייה מסייע לאתר את מקורו של השתקפויות.
מסנן הקרינה או זכוכית יכול גם לגרום חפץ, בעיקר מדגם הקרינה נמוכה, אבל זה יכול בקלות להיות מזוהה על ידי לקיחת דגימה ללא מדידה: אם ריקבון מתקבל בנסיבות אלה, בשל מכשיר ואין לו מה לעשות עם מדגם! לעומת זאת, לציין כי autofluorescence מדגם עשוי גם לתרום ריקבון פלואורסצנטי.
בספירת הזמן בקורלציה פוטון יחיד (TCSPC), ממיר את זמן היציאה משרעת (TAC) שאינם linearities עלול לגרום התקפי עניים, אבל ניתן לזהות על ידי חסימת עירור ומבריק אור הסביבה, למשל ממקור האור המועבר על מדגם ומדידת העיתוי. הרקע צריך להיות קבועהושגו כל פיקסל של התמונה. באזורים בהם חריגות רקע קבוע להתרחש, לא תניב בכושר טוב, יש להימנע למדידת אם לא ניתן למנוע על ידי התאמת הפרמטרים של כרטיס TCSPC.
אחד החפץ לשמצה TCSPC הוא פוטון ערימת-up אשר נגרמת על ידי שיעור גילוי גבוה מדי פוטון. 11,12 זה מוביל פוטון רק 1 בזמן, תוך התעלמות כל הפוטונים הבאים בגלל האלקטרוניקה הם העיתוי עסוק ועיבוד פוטון 1. עורמים מוקפצים מוביל קיצור של פעם בחיים הקרינה, והדרך הטובה ביותר למנוע זאת היא לשמור על קצב הספירה פוטון ב 1% סביב שער החזרה לייזר.
השקפה
ישנם יישומים שונים של FLIM, וכן, בהתאם ליישום, כל אחד מהם יש יתרונות וחסרונות. 13 מיקרוסקופ פלואורסצנטי האידיאלי היה לרכוש את כל ממדי הקרינה emissioקווי המתאר של n, עמדה עוצמת הגל, חייו ואת הקיטוב במדידה אחת, עם רגישות פוטון יחיד, רזולוציה מרחבית מקסימלית בזמן רכישת מינימום. אין כיום שום טכנולוגיה עם שילוב ייחודי זה של תכונות, ולבנות 1 עדיין מהווה אתגר עבור מפתחים מכשור. יישום של טכניקות פיזיות חדשים לבעיות חשובות בביולוגיה של התא היא לעתים קרובות הדרך תגליות בלתי צפויות, ויש עוד דרך ארוכה לעבור לפני שאנחנו קרובים להרוות את היכולות של דימות פלואורסצנטי של ביולוגיה של התא. אכן, הדמיה פרמטרים הקרינה כמו בחיים, קשת ואת הקיטוב, כמו גם הדמיה מהר יותר ב-3D ברזולוציה מרחבית גבוהה יותר, בטוחים כדי לחשוף היבטים חדשים בביולוגיה של התא.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
MKK מודה הנדסה של בריטניה גופני מדעי המועצה למחקר (EPSRC) מדעי החיים תוכנית ממשק עבור אחוות אישי. אנו רוצים גם להודות מימון על ידי ביוטכנולוגיה של בריטניה מחקר מדעי הביולוגיה המועצה (BBSRC).
Materials
Sample with fluorescent molecular rotors
Hardware:
inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope
Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources
Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP
cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors
DCC 100 detector control module
Software:
TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl
References
- Luby-Phelps, K. Cytoarchitecture and physical properties of cytoplasm: Volume, viscosity. diffusion, intracellular surface area. International Review of Cytology – a Survey of Cell Biology. , 192-1189 (2000).
- Stutts, M. J., Canessa, C. M., Olsen, J. C., Hamrick, M., Cohn, J. A., Rossier, B. C., Boucher, R. C. CFTR as a CAMP-dependent regulator of sodium channels. Science. 269, 847-850 (1995).
- Dondorp, A. M., Angus, B. J., Hardeman, M. R., Chotivanich, K. T., Silamut, K., Ruangveerayuth, R., Kager, P. A., White, N. J., Vreeken, J. Prognostic significance of reduced red blood cell deformability in severe falciparum malaria. Am. J. Trop. Med. Hyg. 57, 507-511 (1997).
- Haidekker, M. A., Nipper, M., Mustafic, A., Lichlyter, D., Dakanali, M., Theodorakis, E. A., Demchenko, A. P. . Advanced Fluorescence Reporters in Chemistry and Biology I. Fundamentals and Molecular Design. 8, 267-308 (2010).
- Haidekker, M. A., Theodorakis, E. A. Environment-sensitive behavior of fluorescent molecular rotors. J. Biol. Eng. 4, (2010).
- Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Levitt, J. A., Suhling, K. Molecular Rotor Measures Viscosity of Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging. Journal of the American Chemical Society. 130, 6672-6673 (2008).
- Levitt, J. A., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Chung, P. H., Suhling, K., Phillips, D. Membrane-Bound Molecular Rotors Measure Viscosity in Live Cells via Fluorescence Lifetime Imaging. Journal of Physical Chemistry C. 113, 11634-11642 (2009).
- Hungerford, G., Allison, A., McLoskey, D., Kuimova, M. K., Yahioglu, G., Suhling, K. Monitoring Sol-to-Gel Transitions via Fluorescence Lifetime Determination Using Viscosity Sensitive Fluorescent Probes. J. Phys. Chem. B. 113, 12067-12074 (2009).
- Förster, T., Hoffmann, G. Die Viskositätsabhängigkeit der Fluoreszenzquantenausbeuten einiger Farbstoffsysteme. Zeitschrift für Physikalische Chemie Neue Folge. 75, 63-76 (1971).
- vandeVen, M., Ameloot, M., Valeur, B., Boens, N. L. Pitfalls and Their Remedies in Time-Resolved Fluorescence Spectroscopy and Microscopy. J. Fluores. 15, 377-413 (2005).
- Becker, W. . Advanced Time-Correlated Single Photon Counting Techniques. , (2005).
- O’Connor, D. V., Phillips, D. . Time-correlated single-photon counting. , (1984).
- Suhling, K., French, P. M. W., Phillips, D. Time-resolved fluorescence microscopy. Photochem. Photobiol. Sci. 4, 13-22 (2005).
- Barber, P. R., Ameer-Beg, S. M., Gilbey, J., Carlin, L. M., Keppler, M. D., Ng, T. C., Vojnovic, B. Multiphoton time-domain fluorescence lifetime imaging microscopy: practical application to protein-protein interactions using global analysis. Journal of the Royal Society – Interface. 6, S93-S105 (2009).
