Imagens Lifetime fluorescência (FLIM) emergiu como uma técnica de imagem chave para o meio ambiente e interacção de proteínas específicas e corantes em células vivas. FLIM de rotores moleculares fluorescentes permite o mapeamento de viscosidade em células vivas.
A difusão é muitas vezes um passo de taxa de determinação importante nas reacções químicas ou processos biológicos e desempenha um papel em uma grande variedade de eventos intracelulares. A viscosidade é um dos parâmetros importantes que afectam a difusão de moléculas e proteínas, e as alterações na viscosidade têm sido associados a doença e mau funcionamento, ao nível celular. 1-3 Embora os métodos para medir a viscosidade a granel são bem desenvolvida, microviscosidade imagiologia permanece um desafio . Mapas de viscosidade de objectos microscópicos, tais como as células individuais, têm até recentemente sido difícil de obter. Viscosidade mapeamento com técnicas de fluorescência é vantajoso porque, semelhante a outras técnicas ópticas, é minimamente invasiva, não destrutivo e pode ser aplicado a células vivas e tecidos.
Fluorescentes rotores moleculares exibem tempos de vida de fluorescência e os rendimentos quânticos que são uma função da viscosidade do seu microambiente. Torção intramolecular 4,5 ourotação leva a não-radiativa de decaimento da parte de trás estado animado para o estado fundamental. Um ambiente viscoso diminui essa rotação ou torção, restringindo o acesso a esta via decomposição não-radiativa. Isto leva a um aumento do rendimento quântico de fluorescência eo tempo de vida de fluorescência. Imagens Lifetime fluorescência (FLIM) de modificados corantes BODIPY hidrofóbicos que actuam como fluorescentes rotores moleculares mostram que o tempo de vida de fluorescência destas sondas é uma função do microviscosidade do seu ambiente. 6-8 Um gráfico logarítmico do tempo de vida de fluorescência versus os rendimentos viscosidade do solvente uma linha recta que obedece à equação Förster Hoffman. 9 Este lote também serve como uma curva de calibração para converter tempo de vida de fluorescência em viscosidade.
Após a incubação de células vivas com o modificado BODIPY rotor fluorescente molecular, uma distribuição de corante ponteada é observada nas imagens de fluorescência. O valor da viscosidade obtida em poe puncta em células vivas é de cerca de 100 vezes maior do que a da água e do citoplasma celular. 6,7 tempo resolvido medições de anisotropia de fluorescência produzir tempos de correlação rotacional de acordo com estes valores microviscosidade grandes. Mapeamento o tempo de vida de fluorescência é independente da intensidade de fluorescência, e, assim, permite a separação de concentração da sonda e efeitos de viscosidade.
Em resumo, temos desenvolvido uma abordagem prática e versátil para mapear o microviscosidade em células baseado em FLIM de fluorescentes rotores moleculares.
FLIM oferece algumas vantagens sobre a intensidade baseada em imagens de fluorescência. Pode informar sobre acontecimentos fotofísicas que são difíceis ou impossíveis de observar por imagem intensidade de fluorescência, porque pode separá-los contra os efeitos de concentração fluoróforo. Isto é particularmente útil para o mapeamento de viscosidade intracelular por imagem fluorescente rotores moleculares. O tempo de vida de fluorescência pode ser prontamente convertido em uma viscosidade usando um gráfico de calibração, como mostrado na fig. 3, independente da concentração de fluorescentes rotores moleculares.
Em FLIM pode haver artefactos que possam complicar a interpretação dos dados. 10 artefactos incluem Instrumental luz dispersa que vai aparecer como um pico no topo do início do decaimento da fluorescência e pode ser confundida com um tempo de decaimento curto, ou um pequeno pico após o IRF que pode ser causada por reflexões no interior do microscópio. Estes artefactos de luz dispersos podem ser identificados como talporque eles podem ser distinguidos com a discriminação espectral – eles estão sempre no mesmo comprimento de onda da luz excitante. Lembrando que no ar, a luz viaja 30 cm em 1 nanossegundo ajuda a identificar a origem de reflexões.
Filtro de vidro ou de fluorescência pode também causar um artefacto, especialmente a fluorescência da amostra baixa, mas isto pode ser facilmente identificado por tendo uma medição sem a amostra: se um decaimento é obtido sob estas circunstâncias, é devido ao instrumento e não tem nada a ver com a amostra! Por outro lado, note que autofluorescência amostra pode também contribuir para um decaimento da fluorescência.
Em tempo de contagem correlacionada fotão único (TCSPC), tempo-para-amplitude conversor (TAC) não-linearidades podem causar ataques pobres, mas podem ser identificadas através do bloqueio da excitação e brilhante de luz ambiente, por exemplo, a partir da fonte de luz transmitida sobre a amostra e medindo o tempo. Um fundo deve ser constanteobtido em cada pixel da imagem. Regiões onde desvios a partir de um fundo constante ocorrer, nunca irá produzir um bom ajuste e deve ser evitado para a medição se eles não podem ser eliminados por ajustar os parâmetros para a placa de TCSPC.
Um artefato é infame em TCSPC fóton pile-up que é causada por demasiado elevada taxa de detecção de um fóton. 11,12 Isto leva a apenas fóton o primeiro a ser cronometrado, ignorando os fótons subseqüentes porque os componentes eletrônicos são tempo ocupado e processar o primeiro fóton. Amontoado conduz a um encurtamento do tempo de vida de fluorescência, ea melhor maneira de evitar esta é a de manter a taxa de contagem de fotão em cerca de 1% da taxa de repetição do laser.
Perspectiva
Existem várias implementações de FLIM, e, dependendo da aplicação, cada um tem as suas vantagens e desvantagens. 13 microscópio de fluorescência O ideal seria adquirir a totalidade multidimensional fluorescência emission contorno de intensidade, posição, comprimento de onda da vida, e polarização em uma única medição, com sensibilidade de fóton único, resolução espacial máximo e mínimo tempo de aquisição. Não há atualmente tecnologia com esta combinação única de características, e para construir um continua sendo um desafio para os desenvolvedores de instrumentação. A aplicação de novas técnicas físicas para problemas importantes em biologia celular é muitas vezes o caminho para descobertas inesperadas, e há um longo caminho a percorrer antes de estarmos perto de saturar as capacidades de imagens de fluorescência para a biologia celular. Com efeito, os parâmetros de imagens de fluorescência, tais como tempo de vida, espectro e polarização, bem como uma imagem mais rapidamente em 3D com maior resolução espacial, são determinados para revelar novos aspectos da biologia celular.
The authors have nothing to disclose.
MKK graças Engenharia do Reino Unido e Ciências Físicas Research Council (EPSRC) programa Life Sciences interface para uma bolsa pessoal. Gostaríamos também de agradecer pelo financiamento de Biotecnologia do Reino Unido e Ciências Biológicas Research Council (BBSRC).
Sample with fluorescent molecular rotors
Hardware:
inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope
Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources
Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP
cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors
DCC 100 detector control module
Software:
TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl