Imágenes de fluorescencia vida (Flim) ha surgido como una técnica clave para la imagen del medio ambiente y la interacción de proteínas específicas y colorantes en las células vivas. Flim de los rotores moleculares fluorescentes permite el mapeo de la viscosidad en las células vivas.
La difusión es a menudo un importante determinante de la velocidad paso en las reacciones químicas o procesos biológicos y juega un papel en una amplia gama de eventos intracelulares. La viscosidad es uno de los parámetros clave que afectan a la difusión de las moléculas y proteínas, y cambios en la viscosidad se han relacionado con la enfermedad y el mal funcionamiento en el nivel celular. 1-3 Si bien los métodos para medir la viscosidad a granel están bien desarrolladas, microviscosidad imagen sigue siendo un reto . Mapas de viscosidad de los objetos microscópicos, como las células individuales, que hasta hace poco difícil de obtener. Mapeo de viscosidad con técnicas de fluorescencia es ventajoso porque, similar a otras técnicas ópticas, es mínimamente invasiva, no destructiva y se puede aplicar a las células vivas y tejidos.
Fluorescentes rotores moleculares exhiben tiempos de vida de fluorescencia y los rendimientos cuánticos que son una función de la viscosidad de su microambiente. Torsión intramolecular 4,5 orotación conduce a la decadencia no radiativo de la parte posterior estado excitado al estado fundamental. Un ambiente viscoso reduce esta rotación o torsión, restringir el acceso a esta vía de desintegración no radiativa. Esto conduce a un aumento en el rendimiento cuántico de fluorescencia y la vida de fluorescencia. Imágenes vida de fluorescencia (Flim) de colorantes modificados BODIPY hidrófobos que actúan como fluorescentes rotores moleculares muestran que el tiempo de vida de fluorescencia de estas sondas es una función de la microviscosidad de su entorno. 6-8 Una representación logarítmica de la vida de fluorescencia frente a los rendimientos de viscosidad del disolvente una línea recta que obedece a la ecuación de Förster Hoffman. 9 Esta trama también sirve como una curva de calibración para convertir toda la vida de fluorescencia en la viscosidad.
Después de la incubación de las células vivas con el BODIPY modificada fluorescente rotor molecular, una distribución puntiforme colorante se observa en las imágenes de fluorescencia. El valor de la viscosidad obtenida en ªe puncta en células vivas es de alrededor de 100 veces mayor que la del agua y del citoplasma celular. 6,7 resueltos tiempo mediciones de anisotropía de fluorescencia ceder veces rotacionales de correlación de acuerdo con estos valores microviscosidad grandes. Mapeo de la vida de fluorescencia es independiente de la intensidad de fluorescencia, y por lo tanto permite la separación de concentración de la sonda y los efectos de viscosidad.
En resumen, hemos desarrollado un enfoque práctico y versátil para asignar el microviscosidad en las células sobre la base de Flim de los rotores moleculares fluorescentes.
Flim ofrece algunas ventajas clave sobre la intensidad basada en imágenes de fluorescencia. Se puede informar sobre los eventos fotofísicas que son difíciles o imposibles de observar por imágenes de la intensidad de fluorescencia, ya que se pueden separar de los efectos de la concentración de fluoróforo. Esto es particularmente útil para el mapeo de viscosidad intracelular por imagen molecular rotores fluorescentes. La vida de fluorescencia puede ser fácilmente convertido en una viscosidad usando una curva de calibración, como se muestra en la fig. 3, independiente de la concentración de los rotores moleculares fluorescentes.
En Flim puede haber artefactos que pueden complicar la interpretación de los datos. 10 artefactos instrumentales incluyen la luz dispersa, que se mostrará como un pico en la parte superior del inicio de la decadencia de fluorescencia y se puede confundir con un tiempo de decaimiento corto, o un pequeño pico después de la IRF que puede ser causada por las reflexiones en el interior del microscopio. Estos artefactos de luz dispersos puede ser identificada como talporque se pueden distinguir con la discriminación espectral – son siempre a la misma longitud de onda como la luz de excitación. Recordando que en el aire, la luz viaja a 30 cm en 1 nanosegundo ayuda a precisar el origen de las reflexiones.
Filtro o fluorescencia de vidrio también puede causar un artefacto, especialmente en la fluorescencia de la muestra bajo, pero esto puede ser fácilmente identificado por tomar una medida sin la muestra: si una descomposición se obtiene bajo estas circunstancias, es debido a que el instrumento y no tiene nada que ver con la muestra! Por otro lado, nótese que autofluorescencia muestra también puede contribuir a un decaimiento de fluorescencia.
Con el tiempo-correlacionada conteo de fotones simple (TCSPC), convertidor de tiempo de amplitud (TAC) no linealidades puede causar ataques pobres, pero se pueden identificar mediante el bloqueo de la excitación y brillante de luz ambiental, por ejemplo, de la fuente de luz transmitida sobre la muestra y medir el tiempo. Un fondo debe ser constanteobtenida en cada píxel de la imagen. Las regiones donde las desviaciones de un fondo constante ocurrir, nunca producirá un buen ajuste y deben ser evitados para la medición, si no pueden ser eliminadas mediante el ajuste de los parámetros para la tarjeta TCSPC.
Un artefacto infame en TCSPC es fotón amontonamiento que es causada por una muy alta tasa de detección de fotones. 11,12 Esto conduce a sólo el primer fotón está temporizado, ignorando cualquier fotones posteriores debido a los componentes electrónicos son temporización ocupado y procesar el primer fotón. Pile-up conduce a un acortamiento de la vida de fluorescencia, y la mejor manera de evitar esto es mantener la tasa de recuento de fotones en torno al 1% de la tasa de repetición del láser.
Punto de vista
Hay varias implementaciones de Flim, y, dependiendo de la aplicación, cada uno tiene sus ventajas e inconvenientes. 13 El microscopio de fluorescencia ideal sería adquirir la totalidad multidimensional fluorescencia emission del contorno de intensidad, posición, tiempo de vida, longitud de onda y la polarización en una sola medición, con una sensibilidad de fotón único, la resolución espacial máxima y el tiempo de adquisición mínimo. Actualmente no hay tecnología con esta combinación única de características, y para construir una sigue siendo un reto para los desarrolladores de instrumentación. La aplicación de nuevas técnicas físicas para los problemas importantes en la biología celular es a menudo el camino a los descubrimientos inesperados, y hay un largo camino por recorrer antes de que estemos cerca de la saturación de las capacidades de las imágenes de fluorescencia de la biología celular. En efecto, los parámetros de fluorescencia de imagen tales como la vida, el espectro y la polarización, así como imágenes con mayor rapidez en 3D en alta resolución espacial, es seguro que revelan nuevos aspectos de la biología celular.
The authors have nothing to disclose.
MKK gracias Ingeniería del Reino Unido y Ciencias Físicas Research Council (EPSRC) La vida del programa Ciencias de la interfaz de una beca de personal. También queremos agradecer a los fondos por la Biotecnología del Reino Unido y Ciencias Biológicas de Investigación (BBSRC).
Sample with fluorescent molecular rotors
Hardware:
inverted Leica TCS SP2 confocal scanning microscope
Coherent Mira 900 Ti:Sapphire femtosecond laser with a Verdi V6 pump laser or Hamamatsu PLP-10 470 picosecond pulsed diode laser excitation sources
Becker & Hickl SPC 830 board in 3GHz, pentium IV, 1GB RAM computer with Windows XP
cooled Becker & Hickl PMC100-01 detector head based on Hamamatsu H5773P-01 photomultipliers, mounted on microscope’s X1 port, or hybrid detectors
DCC 100 detector control module
Software:
TRI-214 or SPCImage 2.8 by Becker & Hickl