Lifetime Imaging di fluorescenza di rotori molecolari nelle cellule viventi

I protocolli per la preparazione del campione FLIM non differiscono da quelli per confocale o wide-field-based intensità microscopia a fluorescenza. L'acquisizione dei dati è seguito dal compito principale di analisi dati, cioè estrarre i tempi di vita di fluorescenza dai dati grezzi. Una volta che questi sono stati ottenuti, l'interpretazione dei dati consente di verificare o falsificare le ipotesi. 1. Cellule colorazione con rotori molecolari Preparare una soluzione stock (10 ml) sciogliendo circa 1 mg / ml del colorante in un solvente appropriato (ad esempio metanolo per BODIPY-C 12) 6,7 usando una bilancia accurata e una pipetta. Le cellule (un cancro linea modello cellulare, HeLa nel nostro caso) per essere tinto sono coltivate su una piastra a cavità multiple con un lato coverslide per microscopia, in un incubatore a 37 ° C con 5% CO 2 atmosfera fino ~ 80% confluenti . Aggiungere 10-20 microlitri della soluzione madre alle cellule viventi che crescono in un multi-well piastra (50 SmartSlide micro-incubazione sistema, WaferGen) in 4 ml di Opti-MEM (GIBCO) per pozzetto per una piastra da 6 pozzetti. Ciò produce un micro-molare concentrazione di colorante nel pozzo. Riportare la piastra multipozzetto ad un incubatore a 37 ° C con 5% CO 2 ambiente per 10-45 minuti per la colorazione. Rimuovere la piastra multipozzetto dall'incubatore e lavare le cellule 3-4 volte con 4 ml di medium cell otticamente trasparente della cultura (ad esempio, Opti-MEM) per eliminare il colorante in eccesso. Trasferire la piastra a cavità multiple alla fase microscopio e connettersi ad un controllore di temperatura / 5% CO 2 entrata del gas come richiesto, in preparazione per l'imaging. 2. FLIM di rotori molecolari fluorescenti in cellule Posizionare il campione sul microscopio scena e ottenere una trasmissione e immagine di fluorescenza per identificare le cellule fluorescenti. Un diagramma schematico del set-up sperimentale è mostrato in fig. 1.Verify che emana fluorescenza dalla espe posizionicted (es membrana cellulare, citoplasma). Ottenere uno spettro di emissione di fluorescenza, e verificare che è quello del colorante o proteine ​​previsto, in questo caso lo spettro del rotore molecolare. Come controllo negativo, l'immagine non-tinto campione e verificare che non è fluorescente. Sebbene questo passaggio non è essenziale specificamente per FLIM, è buona in generale e aiuta a verificare che il campione è quello che si pensa che sia. Passa alla modalità FLIM – questo è facilmente eseguita spostando uno specchio di fuori del percorso fluorescenza fascio di rilevamento ("esterno detector" Cliccare su "percorso del raggio setting" sul pannello di controllo del software Leica TCS SP2 di acquisizione). Un filtro appropriato emissione di fluorescenza a bloccare qualsiasi luce eccitante di raggiungere il rivelatore deve essere in beampath rivelazione della fluorescenza. Figura 1. Disposizione sperimentale per dominio del tempo utilizzando FLIM aclaser onfocal microscopio a scansione. Eseguire la scansione del campione e verificare, sul computer che controlla l'acquisizione FLIM, che il tasso di conteggio del rivelatore (barra nera etichettato CFD sul software di controllo acquisizione del Becker & Hickl SPC 830 a bordo) non più di circa l'1% del tasso di ripetizione del laser ( barra verde etichettato software di acquisizione di controllo SYNC). Se è, ridurre l'intensità di eccitazione laser, ad esempio inserendo un filtro a densità neutra nel percorso del raggio laser, per evitare di raccogliere pile-up curve distorte decadimento della fluorescenza. Acquisire un'immagine FLIM, tipicamente per 3-5 minuti, fermare la scansione e salvare i dati grezzi (un 3D di dati "cubo" composto da coordinate spaziali x e y, e il tempo). Aprire i dati grezzi del pacchetto software di analisi di fluorescenza di decadimento, per esempio TRI-2 14 o software commerciale, per visualizzare l'immagine intensità di fluorescenza. Questo è semplicemente il decadimento fluorescenza integrato, cioè l'area sotto la curva di decadimento di fluorescenza, in ciascunpixel. Selezionare un pixel tipica posizionando il cursore su di esso, e controllare il decadimento di fluorescenza in quel pixel. Se il conteggio di picco è inferiore a 100, utilizzare binning spaziale di pixel. I conteggi di pixel adiacenti (ad esempio 3×3 o 5×5) vengono aggiunti nel pixel centrale, in modo che un numero maggiore di picco è ottenuto. Ciò fornisce una maggiore precisione statistica per il passaggio successivo. In alternativa, la misurazione può essere ripetuta per un più lungo tempo di acquisizione (fase 5). Per i 30-50min, un conteggio di circa 10 volte superiore di picco (e conte totali) viene ottenuto, ma questa è troppo lungo un tempo di acquisizione per la maggior parte dei campioni biologici per il pericolo di introdurre artefatti dovuti al movimento del campione, la deriva microscopio, fototossicità e photobleaching. Selezionare un valore di soglia globale pixel (sopra la quale il decadimento in un pixel è montato) e applicare un accoppiamento unico decadimento esponenziale all'immagine. Il risultato produce una vita di fluorescenza per ciascun pixel sopra la soglia, che viene poi codificato incolore. Ogni pixel viene colorato con il risultato della misura, e una mappa FLIM si ottiene. Controllare i ridotti valori di chi-quadrato per vari pixels – circa 1 (e fino a 1.3) indica una buona forma. Controllare i residui corrispondenti, che dovrebbero essere distribuiti casualmente intorno allo zero. La fluorescenza durata istogramma la frequenza con cui si verificano determinati tempi di vita di fluorescenza contro la vita stessa di fluorescenza. Regolare la gamma di colori in modo tale che la distribuzione durata della fluorescenza si inserisce nella gamma di colori. Se un accoppiamento monoesponenziale non produce un valore di chi-quadrato di circa 1 (e fino a 1,3), e vi è una deviazione sistematica dei residui da zero, un modello più sofisticato è richiesto. Ad esempio, vai a montare un modello a doppio esponenziale per i decadimenti fluorescenza, per tenere conto di due diversi ambienti la sonda può essere poll L'adattamento anche dare i pre-esponenziali fattori o ampiezze che danno un'indicazione della quantità relativa di colorante in uno ambientemento o l'altro. In alternativa, una funzione esponenziale allungato può essere opportuno rappresentano una distribuzione di vite fluorescenza. I risultati per le durate di fluorescenza, pre-esponenziali fattori, e il rapporto di vita e la pre-esponenziale rapporto fattore per ciascun pixel può essere codificato a colori. Ogni pixel è colorato in base al suo valore, e il contrasto a causa di tempi di vita di fluorescenza, pre-esponenziale dei fattori e dei loro rapporti si ottiene. Anche in questo caso, controllare i ridotti valori di chi-quadrato (che può anche essere codificati a colori e visualizzati sotto forma di immagine) – circa 1 (e fino a 1.3) indica una buona forma. Controllare i residui, che devono essere distribuiti casualmente intorno allo zero. Istogrammi durata della fluorescenza deve accompagnare tutte le immagini per una visualizzazione semplice dei valori medi di durata della fluorescenza, la distribuzione e la durata della fluorescenza. 3. Risultati rappresentativi Decadimenti di fluorescenza misuratail rotore fluorescente molecolare ad aumentare la viscosità in metanolo / glicerolo miscele sono mostrati nella fig. 2. I decade fluorescenza sono monoesponenziale, e la vita di fluorescenza varia sensibilmente in funzione della viscosità. Aumenta da circa 300 ps in metanolo (0,6 viscosità cP) a 3,4 ns nel 95% glicerolo (viscosità 950 cP). Profili decadimento Figura 2. Fluorescenza per BODIPY-C 12 in metanolo / glicerolo miscele di viscosità varia 6. Il diagramma di taratura logaritmica della durata della fluorescenza rispetto a τ viscosità η per il rotore fluorescente molecolare è mostrato in fig. 3. Si tratta di una linea retta come richiesto dall'equazione Förster Hoffman 9 dove k è 0 la radiativvelocità e costante, e Z e X sono costanti, con 0 <x <1. Prendendo il logaritmo su entrambi i lati rese dove x è la pendenza della retta. Figura 3. Un grafico di log fluorescenza viscosità log vs vita per BODIPY C-12 produce una linea retta secondo la Förster-Hoffmann equazione 6. Dopo l'incubazione delle cellule viventi con il rotore fluorescente molecolare una distribuzione puntiforme colorante si osserva nelle immagini di fluorescenza. FLIM immagini di cellule HeLa incubate con un colorante meso-sostituito BODIPY sono mostrati nella fig. 4. I decade di fluorescenza in ogni pixel dell'immagine può essere adeguatamente montate con un unico modello di decadimento esponenziale. <p class="jove_content"> Figura 4. (A) L'intensità della fluorescenza e (b) FLIM immagini di cellule HeLa colorati con BODIPY-C 12. Le luminose regioni puntuate mostrano una vita più breve rispetto ad altre regioni. Questo liftime inferiore corrisponde ad una viscosità più bassa nel puncta, goccioline lipidiche probabilmente, secondo la Förster-Hoffmann equazione. Riportando i tempi di vita estratti da ogni pixel, si ottiene un istogramma di fluorescenza vita dell'intera immagine come mostrato in fig. 5. Figura 5. Istogrammi di vite fluorescenza da immagini FLIM di cellule HeLa colorati con meso-sostituiti BODIPY rotori molecolari.