Summary

Siete pasos para células estrelladas

Published: May 10, 2011
doi:

Summary

Aquí se describe un método para el aislamiento de las células estrelladas hepáticas del hígado de ratón. Para la purificación de células estrelladas, hígados de los ratones se digieren<em> In situ</em> Y<em> In vitro</em> Por el tratamiento pronasa colagenasa antes de la centrifugación en gradiente de densidad. Esta técnica produce células hepáticas estrelladas de alta pureza.

Abstract

Las células estrelladas hepáticas son residentes del hígado de las células de la estrella-como la morfología y se encuentran en el espacio de Disse entre el hígado y las células endoteliales sinusoidales 1,2 hepatocitos. Las células estrelladas se derivan de los precursores de la médula ósea y almacenar hasta 80% de la vitamina A del cuerpo total de 1, 2. Tras la activación, las células estrelladas se diferencian en miofibroblastos para producir la matriz extracelular, contribuyendo así a la fibrosis del hígado 3. Con base en su capacidad para contratar, las células estrelladas miofibroblástico puede regular el tono vascular asociado a la hipertensión portal 4. Recientemente, hemos demostrado que las células estrelladas hepáticas son potentes células presentadoras de antígeno y puede activar las células NKT, así como los linfocitos T convencionales 5.

Aquí presentamos un método para la preparación eficaz de las células estrelladas hepáticas del hígado de ratón. Debido a su localización perisinusoidal, el aislamiento de las células estrelladas hepáticas es un proceso de múltiples pasos. A fin de que las células estrelladas accesible para el aislamiento del espacio de Disse, hígados de los ratones son perfundidos in situ con el Pronasa digestivo E enzimas colagenasa y la perfusión P. Después, el tejido hepático se somete a tratamiento enzimático adicional con pronasa E y P en la colagenasa vitro. Posteriormente, el método se aprovecha de la enorme cantidad de gotas de vitamina A de lípidos que almacena en las células estrelladas hepáticas. Esta característica permite la separación de las células estrelladas hepáticas de otros tipos de células por centrifugación en un 8% de pendiente Nycodenz. El protocolo descrito aquí produce una población muy pura y homogénea de las células estrelladas. Pureza de las preparaciones pueden ser evaluados mediante la tinción de la molécula de proteína glial fibrilar marcador ácida (GFAP), previo al análisis por microscopía de fluorescencia o citometría de flujo. Además, la microscopía de luz revela el aspecto único de la forma de estrella, las células estrelladas hepáticas que albergan grandes cantidades de gotitas de lípidos.

En conjunto, se presenta un protocolo detallado para el aislamiento eficiente de las células estrelladas hepáticas, incluyendo imágenes representativas de su aspecto morfológico y la expresión de GFAP que ayudan a definir la entidad de células estrelladas.

Protocol

Ratones C57BL / 6 se debe utilizar en aproximadamente 20 semanas de edad o más. El uso de ratones macho de 25 a 30 g se recomienda. El rendimiento de las células estrelladas se puede aumentar por la alimentación de los ratones de la vitamina A dieta enriquecida por 2 meses antes de que el aislamiento de células estrelladas. Aproximadamente 2×10 5 células estrelladas hepáticas pueden purificar a partir del hígado de un C57BL / 6 del ratón, mientras que el rendimiento de las células estrelladas de rato…

Discussion

Las células estrelladas hepáticas regular esenciales los procesos fisiológicos y fisiopatológicos en el hígado. Por otra parte, las células estrelladas poseen propiedades presentadoras de antígeno, lo que hace que un componente importante de la respuesta inmune hepática. Aunque las células estrelladas hepáticas constituyen el 10-15% del número total de células en el hígado, el aislamiento de estas células es un reto debido a su localización en el espacio perisinusoidal de Disse.

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Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue financiado por el Premio de la familia Smith a la Excelencia en la Investigación Biomédica y el NIH RO1 AI083426-01 (FW). Patrick Maschmeyer Flach y Melanie son compatibles con becas de doctorado de la Fundación Boehringer Ingelheim.

Materials

Name Of Reagent Company Catalog No.
70μm Cell Strainer BD 352350
CaCL2 x 2H2O Sigma-Aldrich C3306
Collagenase P Roche 11249002001
DMEM Gibco 11960
DNase I Roche 10104159001
DPBS Cellgro 21-031-cv
EGTA Fluka 3777
Fetal Bovine Serum Gibco 16000
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Gradient Centrifugation Tubes Greiner Bio-One 163160
HEPES Gibco 15630
KCL Sigma-Aldrich P9541
KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791
L-Glutamine Gibco 25030
MgCl2 x 6H2O Fluka 63068
MgSO4 x 7H2O Sigma-Aldrich M2773
Na2HPO4 x 2H2O Fluka 71643
NaCl Sigma-Aldrich S3014
NaH2PO4 x H2O Fluka 71507
NaHCO3 Fluka 71628
Nycodenz Accudenz AG AN7050/BLK
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140
Peristaltic Pump Cole Parmer HV-7523-70
Phenol Red Sigma-Aldrich P4633
Pronase E Calbiochem 7433-2
Silicone Tube Masterflex HV-96440-14
Sodium Pyruvate Gibco 11360
Tissue culture flask (25cm2) BD 353108
Winged Infusion Set Terumo 1SV27EL

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Cite This Article
Maschmeyer, P., Flach, M., Winau, F. Seven Steps to Stellate Cells. J. Vis. Exp. (51), e2710, doi:10.3791/2710 (2011).

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