Summary

Zeven Stappen naar cellen stellatum

Published: May 10, 2011
doi:

Summary

Hier beschrijven we een methode voor de isolatie van leverstellaatcellen van muis lever. Voor stellaatcellen cel zuivering, muis levers verteerd<em> In situ</em> En<em> In vitro</em> Door pronase-collagenase behandeling voorafgaand aan de dichtheidsgradiënt centrifugeren. Deze techniek levert zeer zuivere leverstellaatcellen.

Abstract

Stellaatcellen zijn lever-ingezeten cellen van ster-achtige morfologie en bevinden zich in de ruimte van Disse tussen lever sinusoïdale endotheelcellen en hepatocyten 1,2. Stellaatcellen zijn afgeleid van het beenmerg precursoren en opslaan van maximaal 80% van het totale lichaam vitamine A 1, 2. Bij de activering stellaatcellen differentiëren in myofibroblasten aan de extracellulaire matrix te produceren, en aldus bijdragen tot leverfibrose 3. Op basis van hun vermogen om contract, kan myofibroblastic stellaatcellen reguleren van de vasculaire tonus geassocieerd met portale hypertensie 4. Onlangs toonden we aan dat leverstellaatcellen zijn potente antigeen presenterende cellen en kan activeren NKT-cellen evenals conventionele T-lymfocyten 5.

Hier presenteren we een methode voor de efficiënte voorbereiding van leverstellaatcellen van muis lever. Door hun perisinusoïdale lokalisatie, de isolatie van leverstellaatcellen is een multi-step proces. Met het oog op stellaatcellen toegankelijk voor isolatie van de ruimte van Disse maken, muis levers worden perfusie in situ met de spijsverteringsenzymen pronase E en Collagenase P. Na perfusie, is de lever weefsel onderworpen aan een extra enzymatische behandeling met pronase E en Collagenase P in vitro. Vervolgens heeft de methode maakt gebruik van de enorme hoeveelheid vitamine A-opslag van lipide druppels in leverstellaatcellen. Deze functie kan de scheiding van stervormige cellen uit andere lever celtypen door centrifugeren op een 8% Nycodenz verloop. Het protocol hier beschreven geeft een zeer zuivere en homogene populatie van stellaatcellen. Zuiverheid van de voorbereiding kan worden beoordeeld door kleuring voor de marker molecule gliale fibrillaire zuur eiwit (GFAP), voorafgaand aan de analyse van fluorescentie microscopie of flowcytometrie. Verder lichtmicroscopie onthult het unieke uiterlijk van stervormige leverstellaatcellen dat grote hoeveelheden van lipide druppels haven.

Samen genomen, presenteren we een gedetailleerd protocol voor de efficiënte isolatie van leverstellaatcellen, met inbegrip van representatieve beelden van hun morfologische uiterlijk en GFAP expressie die helpen om de stellaatcel cel entiteit te definiëren.

Protocol

C57BL / 6 muizen worden gebruikt op ~ 20 weken oud of ouder. Het gebruik van de mannelijke muizen met een gewicht van 25 30g wordt aanbevolen. De opbrengst van stellaatcellen kan verhoogd worden door het voeren van muizen een vitamine A-verrijkt dieet gedurende 2 maanden voorafgaand aan celisolatie stellatum. Ongeveer 2×10 5 leverstellaatcellen kan worden gezuiverd uit de lever van een C57BL / 6 muis, terwijl de opbrengst van stervormige cellen van Balb / c muizen is aanzienlijk hoger. Het volgende protocol i…

Discussion

Leverstellaatcellen reguleren essentiële fysiologische en pathofysiologische processen in de lever. Bovendien stellaatcellen bezitten antigeen presenterende eigenschappen, waardoor ze een belangrijk onderdeel van de lever immuunrespons. Hoewel leverstellaatcellen bestaan ​​uit 10-15% van het totale aantal cellen in de lever, is isolatie van deze cellen uitdagend als gevolg van hun lokalisatie in de ruimte van Disse perisinusoïdale.

Hier presenteren we een eenvoudige methode om leverste…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door de familie Smith Award for Excellence in biomedisch onderzoek en NIH RO1 AI083426-01 (FW). Patrick Maschmeyer en Melanie Flach worden ondersteund door PhD beurzen van de Boehringer Ingelheim Foundation.

Materials

Name Of Reagent Company Catalog No.
70μm Cell Strainer BD 352350
CaCL2 x 2H2O Sigma-Aldrich C3306
Collagenase P Roche 11249002001
DMEM Gibco 11960
DNase I Roche 10104159001
DPBS Cellgro 21-031-cv
EGTA Fluka 3777
Fetal Bovine Serum Gibco 16000
Glucose Sigma-Aldrich G7528
Gradient Centrifugation Tubes Greiner Bio-One 163160
HEPES Gibco 15630
KCL Sigma-Aldrich P9541
KH2PO4 Sigma-Aldrich P9791
L-Glutamine Gibco 25030
MgCl2 x 6H2O Fluka 63068
MgSO4 x 7H2O Sigma-Aldrich M2773
Na2HPO4 x 2H2O Fluka 71643
NaCl Sigma-Aldrich S3014
NaH2PO4 x H2O Fluka 71507
NaHCO3 Fluka 71628
Nycodenz Accudenz AG AN7050/BLK
Penicillin/Streptomycin Gibco 15140
Peristaltic Pump Cole Parmer HV-7523-70
Phenol Red Sigma-Aldrich P4633
Pronase E Calbiochem 7433-2
Silicone Tube Masterflex HV-96440-14
Sodium Pyruvate Gibco 11360
Tissue culture flask (25cm2) BD 353108
Winged Infusion Set Terumo 1SV27EL

Play Video

Cite This Article
Maschmeyer, P., Flach, M., Winau, F. Seven Steps to Stellate Cells. J. Vis. Exp. (51), e2710, doi:10.3791/2710 (2011).

View Video