細胞星状に7つのステップ
Summary
ここでは、マウスの肝臓から肝星細胞の単離のための方法を説明します。星状細胞の精製のために、マウスの肝臓は、消化されています<em>その場で</em>と<em> in vitroで</em>密度勾配遠心分離の前にプロナーゼ、コラゲナーゼ処理による。この手法は、高純度の肝星細胞が得られます。
Abstract
肝星細胞は星状形態の肝臓常駐細胞であり、肝類洞内皮細胞と肝細胞の1,2の間にDisseの空間に配置されています。星状細胞は、骨髄の前駆体に由来し、全身のビタミン1、2の80％にまで保存されています。活性化されると、星状細胞は、このように肝線維症3に貢献し、細胞外マトリックスを生成するために筋線維芽細胞に分化する。契約する能力に基づいて、筋線維芽細胞星状細胞は、門脈圧亢進症4に関連血管緊張を調節することができる。最近、我々は、肝星細胞は、強力な抗原提示細胞であり、NKT細胞だけでなく、従来のTリンパ球5をアクティブにすることができます示した。
ここでは、マウスの肝臓から肝星細胞の効率的な製造方法を示す。そのperisinusoidalローカライズのために、肝星細胞の分離は、マルチステップのプロセスです。 Disseのスペースから分離へのアクセス星状細胞をレンダリングするためには、マウスの肝臓は、消化酵素のプロナーゼEとコラゲナーゼP.以下の血流とその場で灌流され、肝臓の組織は、プロナーゼEとコラゲナーゼP の持つ追加の酵素処理に供される試験管 。その後、このメソッドは、肝星細胞のビタミンA -を格納する脂肪滴の膨大な量を利用しています。この機能は8％ナイコデンツの勾配で遠心分離によって、他の肝細胞型から星状細胞を分離することができます。ここで説明するプロトコルは、星状細胞の非常に純粋で均一な人口をもたらします。調剤の純度は、蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによる分析の前にマーカー分子グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）、のために染色によって評価することができる。さらに、光学顕微鏡では脂肪滴を大量に抱いて星型肝星細胞のユニークな外観を明らかにする。
一緒になって、我々は、その形態学的外観および星状細胞の実体を定義するために役立つGFAPの発現の代表画像を含む肝星細胞の効率的な分離のための詳細なプロトコールを提示する。
Protocol
Discussion
肝星細胞は肝臓に不可欠な生理学的および病態生理学的プロセスを調節する。また、星状細胞は、それらを肝免疫応答の重要な構成要素をレンダリングする、抗原提示特性を有する。肝星細胞が肝臓の総細胞数の10〜15％を占めるが、これらの細胞の分離は、Disseの類洞周囲腔に局在のために挑戦している。
ここでは、 現場消化およびその後の勾配遠心分離の</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、生物医学研究とNIH RO1 AI083426 – 01（FW）の卓越性のためのスミスファミリー賞によって資金を供給された。パトリックMaschmeyerとメラニーフラックは、ベーリンガーインゲルハイム財団からの博士課程の奨学金によってサポートされています。
Materials
| Name Of Reagent | Company | Catalog No. |
|---|---|---|
| 70μm Cell Strainer | BD | 352350 |
| CaCL2 x 2H2O | Sigma-Aldrich | C3306 |
| Collagenase P | Roche | 11249002001 |
| DMEM | Gibco | 11960 |
| DNase I | Roche | 10104159001 |
| DPBS | Cellgro | 21-031-cv |
| EGTA | Fluka | 3777 |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 16000 |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7528 |
| Gradient Centrifugation Tubes | Greiner Bio-One | 163160 |
| HEPES | Gibco | 15630 |
| KCL | Sigma-Aldrich | P9541 |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P9791 |
| L-Glutamine | Gibco | 25030 |
| MgCl2 x 6H2O | Fluka | 63068 |
| MgSO4 x 7H2O | Sigma-Aldrich | M2773 |
| Na2HPO4 x 2H2O | Fluka | 71643 |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 |
| NaH2PO4 x H2O | Fluka | 71507 |
| NaHCO3 | Fluka | 71628 |
| Nycodenz | Accudenz AG | AN7050/BLK |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140 |
| Peristaltic Pump | Cole Parmer | HV-7523-70 |
| Phenol Red | Sigma-Aldrich | P4633 |
| Pronase E | Calbiochem | 7433-2 |
| Silicone Tube | Masterflex | HV-96440-14 |
| Sodium Pyruvate | Gibco | 11360 |
| Tissue culture flask (25cm2) | BD | 353108 |
| Winged Infusion Set | Terumo | 1SV27EL |
References
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