Мониторинг динамических изменений в митохондриальной уровня кальция во время апоптоза Использование генетически закодированные Кальций датчика
Summary
Этот протокол описывает метод в режиме реального времени измерения потоков митохондриального кальция флуоресцентные изображения. Метод использует циркулярно permutated YFP основе двойного возбуждения логометрических кальция датчика (логометрических pericam-м) выборочно выражается в митохондриях.
Abstract
Dynamic changes in intracellular calcium concentration in response to various stimuli regulates many cellular processes such as proliferation, differentiation, and apoptosis1. During apoptosis, calcium accumulation in mitochondria promotes the release of pro-apoptotic factors from the mitochondria into the cytosol2. It is therefore of interest to directly measure mitochondrial calcium in living cells in situ during apoptosis. High-resolution fluorescent imaging of cells loaded with dual-excitation ratiometric and non-ratiometric synthetic calcium indicator dyes has been proven to be a reliable and versatile tool to study various aspects of intracellular calcium signaling. Measuring cytosolic calcium fluxes using these techniques is relatively straightforward. However, measuring intramitochondrial calcium levels in intact cells using synthetic calcium indicators such as rhod-2 and rhod-FF is more challenging. Synthetic indicators targeted to mitochondria have blunted responses to repetitive increases in mitochondrial calcium, and disrupt mitochondrial morphology3. Additionally, synthetic indicators tend to leak out of mitochondria over several hours which makes them unsuitable for long-term experiments. Thus, genetically encoded calcium indicators based upon green fluorescent protein (GFP)4 or aequorin5 targeted to mitochondria have greatly facilitated measurement of mitochondrial calcium dynamics. Here, we describe a simple method for real-time measurement of mitochondrial calcium fluxes in response to different stimuli. The method is based on fluorescence microscopy of ‘ratiometric-pericam’ which is selectively targeted to mitochondria. Ratiometric pericam is a calcium indicator based on a fusion of circularly permuted yellow fluorescent protein and calmodulin4. Binding of calcium to ratiometric pericam causes a shift of its excitation peak from 415 nm to 494 nm, while the emission spectrum, which peaks around 515 nm, remains unchanged. Ratiometric pericam binds a single calcium ion with a dissociation constant in vitro of ~1.7 μM4. These properties of ratiometric pericam allow the quantification of rapid and long-term changes in mitochondrial calcium concentration. Furthermore, we describe adaptation of this methodology to a standard wide-field calcium imaging microscope with commonly available filter sets. Using two distinct agonists, the purinergic agonist ATP and apoptosis-inducing drug staurosporine, we demonstrate that this method is appropriate for monitoring changes in mitochondrial calcium concentration with a temporal resolution of seconds to hours. Furthermore, we also demonstrate that ratiometric pericam is also useful for measuring mitochondrial fission/fragmentation during apoptosis. Thus, ratiometric pericam is particularly well suited for continuous long-term measurement of mitochondrial calcium dynamics during apoptosis.
Protocol
Discussion
Здесь мы представляем очень простой метод измерения митохондриального кальция использованием митохондриальной ориентированных логометрических pericam. Как показано на рисунке 1а, используя стандартные широкопольных оптики, без деконволюции можно легко просматривать отдельные митохондрии в клетках HeLa с приемлемой сигнал-шум. Это потому, что клетки HeLa, как и большинство клеток в культуре, значительно выравниваются, когда приверженец что исключает необходимость в конфокальной микроскопии или другой специализированной техники. Мы нашли аналогичные результаты в клетках Jurkat придерживался поли-лизин покрытием покровные 8. В отличие от методологии использования красителей, это также возможно для неинвазивного мониторинга митохондриальной уровня кальция в течение нескольких часов с использованием генетически закодированы кальция такие показатели, как логометрических pericam (рис. 1E). Это особенно важно при анализе митохондриальной кальция во время гибели клеток. Кроме того, это также возможно для визуализации деления / фрагментация митохондрий в процессе апоптоза. Как показано на рисунках 1D и Е, стауроспорин лечение вызывает медленное увеличение кальция в отдельных субпопуляций митохондрии которых пики на 20 минут. Кальций уровней спуститься снова одновременно с митохондриальной фрагментации, прежде чем снова через 2 часа после лечения. Это согласуется с медленных волн в цитозольного кальция индуцированных стауроспорин лечения измерялась с помощью Фура-2 9. Таким образом, важной кинетической информацию можно получить, что невозможно с методами использования статических измерений. Хотя мы представили отношения, а не кальция концентрации на рисунке 1, можно откалибровать датчик на месте рассчитать абсолютные уровни кальция, 4, 10. Одним из важных предостережение, чтобы рассмотреть, что логометрических pericam чувствителен к рН 4, 10. Так как оба цитозольного и митохондриальной уровнях рН может резко измениться во время апоптоза 11, это является важным фактором. Титрование рН в изолированных митохондриях выражения pericam демонстрируют, что увеличение [H +] увеличивает выброс pericam при возбуждении на 495 нм, при недостаточном эффекте от излучения стимулируется возбуждение при 410 нм, собственность, которая была использована для одновременного измерения как митохондриальной кальций и рН 12. Таким образом, выборочный контроль выбросов с 410 нм возбуждения предоставляет средства для не-ratiometrically монитор митохондриального кальция со снижением забота о рН. Наконец, протокол, представленные здесь требуется только доступ к стандартным epifluorescent микроскоп с широко доступны фильтры, что делает эту технику доступной для большинства лабораторий.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить Atsushi Miyawaki за предоставление нам логометрических-pericam-т выражение построить. Эта работа была поддержана грантом GM081685 из Национального института здоровья (БД).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. | |
| Imaging Software | Molecular Devices, Inc | Metafluor | ||
| Attofluor cell chamber | Invitrogen Corporation | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Corporation | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies | |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen Corporation | M7512 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Hajnoczky, G. Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis. Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Miyawaki, A. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Shimozono, S. Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein. Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).
- Wozniak, A. L. Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis. J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).
- Boehning, D. Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).
- Csordas, G. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
- Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
