Mudanças Dinâmicas de monitoramento dos níveis de cálcio mitocondrial durante a apoptose através de um sensor de cálcio geneticamente codificado
Summary
Este protocolo descreve um método para medição em tempo real dos fluxos de cálcio mitocondrial por imagem fluorescente. O método se aproveita de uma circular permutated sensor de cálcio YFP baseado excitação dupla raciométrica (raciométrica pericam-mt) seletivamente expressos na mitocôndria.
Abstract
Mudanças dinâmicas na concentração de cálcio intracelular em resposta a vários estímulos regula muitos processos celulares como a proliferação, diferenciação e apoptose 1. Durante a apoptose acúmulo de cálcio, na mitocôndria promove a liberação de fatores pró-apoptóticos da mitocôndria para o citosol 2. É, portanto, de interesse para medir diretamente cálcio mitocondrial em células vivas in situ durante a apoptose. Alta resolução de imagem fluorescente de células carregadas de excitação dupla raciométrica e não raciométrica corantes indicador sintético de cálcio tem sido provado ser uma ferramenta confiável e versátil para estudar vários aspectos da sinalização do cálcio intracelular. Medir os fluxos de cálcio citosólico utilizando estas técnicas é relativamente simples. No entanto, medindo os níveis de cálcio nas células intactas intramitocondrial utilizando indicadores de cálcio sintéticos como Rhod-2 e Rhod-FF é mais desafiador. Indicadores sintéticos direcionados para as mitocôndrias têm embotado respostas repetitivas a um aumento no cálcio mitocondrial, e interromper a morfologia mitocondrial 3. Além disso, indicadores sintéticos tendem a vazar para fora da mitocôndria durante várias horas o que os torna inadequados para experimentos de longa duração. Assim, os indicadores de cálcio geneticamente codificado com base em proteína fluorescente verde (GFP) 4 ou 5 aequorin direcionados para as mitocôndrias têm muito facilitada medição da dinâmica do cálcio mitocondrial. Aqui, descrevemos um método simples para medição em tempo real dos fluxos de cálcio mitocondrial em resposta a estímulos diferentes. O método é baseado em microscopia de fluorescência de 'raciométrica-pericam ", que é seletivamente direcionados para as mitocôndrias. Pericam raciométrica é um indicador de cálcio baseado em uma fusão de circularmente permutados proteína fluorescente amarela e calmodulina 4. A ligação do cálcio para pericam raciométrica provoca uma mudança de seu pico de excitação de 415 nm a 494 nm, enquanto que o espectro de emissão, que picos em torno de 515 nm, permanece inalterado. Raciométrica pericam liga um íon de cálcio com uma única constante de dissociação in vitro de ~ 1,7 mM 4. Estas propriedades do pericam raciométrica permitem a quantificação de mudanças rápidas e de longo prazo na concentração de cálcio mitocondrial. Além disso, descrevemos a adaptação desta metodologia a um padrão de imagem do microscópio de campo amplo de cálcio com comumente disponíveis conjuntos de filtros. Usando dois agonistas distintos, o agonista purinérgico ATP e indução de apoptose estaurosporina de drogas, demonstram que este método é apropriado para monitorar mudanças na concentração de cálcio mitocondrial com uma resolução temporal de segundos a horas. Além disso, também demonstram que pericam raciométrica também é útil para medir a fissão mitocondrial / fragmentação durante a apoptose. Assim, pericam raciométrica é particularmente adequado para a medição contínua de longo prazo da dinâmica do cálcio mitocondrial durante a apoptose.
Protocol
Discussion
Aqui apresentamos um método muito simples para a medição de cálcio mitocondrial utilizando-alvo mitocondrial pericam raciométrica. Conforme mostrado na Figura 1A, usando o padrão Widefield óptica sem deconvolução é possível visualizar facilmente mitocôndrias nas células HeLa individuais com relação sinal-ruído aceitável. Isso ocorre porque as células HeLa, como a maioria das células em cultura, achatar significativamente quando aderente evitando a necessidade de microscopia confocal ou outros equipamentos especializados. Temos encontraram resultados semelhantes em células Jurkat adere a poli-lisina lamínulas revestido 8. Em contraste com metodologias usando corantes, também é possível de forma não invasiva monitorar os níveis de cálcio mitocondrial durante horas utilizando indicadores de cálcio geneticamente codificado como pericam raciométrica (Figura 1E). Isto é especialmente importante quando se analisa o cálcio mitocondrial durante a morte celular. Além disso, também é possível visualizar a cisão / fragmentação da mitocôndria durante o processo de apoptose. Como mostrado nas Figuras 1D e E, o tratamento estaurosporina causa um aumento lento em cálcio em subpopulações seleto de mitocôndrias, que picos em 20 minutos. Níveis de cálcio descer novamente concomitante com a fragmentação mitocondrial antes de subir novamente 2 horas após o tratamento. Isto é consistente com as ondas lentas em cálcio citosólico induzido pelo tratamento estaurosporina medida usando Fura-2 9. Assim, as informações cinética importantes podem ser obtidos que não é possível com métodos que empregam medições estáticas. Embora tenhamos apresentado índices e concentrações de cálcio não na Figura 1, é possível calibrar o sensor in situ para calcular os níveis de cálcio absoluta 4, 10. Uma ressalva importante a considerar é que pericam raciométrica é sensível ao pH 4, 10. Como ambos os níveis de pH citosólico e mitocondrial podem mudar dramaticamente durante a apoptose 11, esta é uma consideração importante. Titulação de pH em pericam mitocôndrias isoladas expressar demonstrar que o aumento da [H +] de emissão aumentos de pericam quando animado em 495 nm, com pouco efeito sobre a emissão estimulada pela excitação a 410 nm, uma propriedade que tem sido explorada para medir simultaneamente tanto cálcio mitocondrial e pH 12. Assim, seletivamente monitoramento de emissões com 410 nm de excitação fornece um meio de não-ratiometrically cálcio mitocondrial acompanhar com preocupação reduzida para pH. Finalmente, o protocolo aqui apresentado requer apenas o acesso a um microscópio de epifluorescência com filtros padrão amplamente disponível, tornando essa técnica acessível para a maioria dos laboratórios.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Atsushi Miyawaki para fornecer-nos com a construção de expressão raciométrica-pericam-mt. Este trabalho foi financiado por bolsa GM081685 do National Institutes of Health (DB).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. | |
| Imaging Software | Molecular Devices, Inc | Metafluor | ||
| Attofluor cell chamber | Invitrogen Corporation | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Corporation | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies | |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen Corporation | M7512 |
References
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