Seguimiento de los cambios dinámicos en niveles de calcio mitocondrial de la apoptosis mediante un sensor de calcio genéticamente codificados

1. Pericam-mt Transfección y preparación de células. Placa de células HeLa la noche antes de la transfección en cubreobjetos de vidrio estériles colocados en una placa de cultivo estándar de 6 pocillos. Preparar ADN / Lipofectamine 2000 complejos como sugerido por el fabricante (Invitrogen). Usamos 4 mg del vector de expresión radiométrica-pericam-mt y 10 l de Lipofectamine 2000 diluido en 0,5 ml de Opti-MEM para cada pozo. Las células deben ser confluentes ~ 70% antes de la transfección. Vuelva a colocar HeLa medios de cultivo (Dulbecco modificado águilas medio, 10% de SFB, penicilina / estreptomicina) en cada pocillo con 1,5 ml del mismo medio sin antibióticos. Añadir los complejos ADN / Lipofectamine a cada pocillo para ser transfectadas. Mezclar suavemente con la oscilación y se incuba durante 4 horas en un cultivo celular incubadora a 37 º C, 5% de CO 2. Reemplazar a los antibióticos sin los medios de comunicación con los medios de cultivo con antibióticos. Permiten a las células para expresar pericam radiométrica por 1-2 días antes de la imagen. 2. Microscopio de instalación y de adquisición de imágenes Coloque un cubreobjetos con células HeLa en una cámara de imágenes apropiadas con una solución de imagen: 107 mm NaCl, KCl 7,2 mm, 1,2 mm de MgCl2, 1 mM CaCl 2, la glucosa 11,5 mm, 0,1% de albúmina de suero bovino, 20 mM HEPES y 7,2. Nuestro laboratorio utiliza la cámara del celular Attofluor de Invitrogen. Monte la cámara de imágenes en una etapa microscopio invertido. Encontrar un área de interés que contienen una o más células que expresan pericam radiométrica con un 40x (o superior) objetivo de inmersión en aceite. Hemos encontrado que pericam radiométrica es menos resistente a photobleaching a 380 nm, y por lo tanto utilizamos esta longitud de onda para identificar las células adecuadas. Para las imágenes adquiridas en la Figura 1, un objetivo Nikon Superfluor 40X con una apertura numérica 1.3 se utilizó. Objetivos más altos de aumento también podría ser adecuado (60-100x). Filtros de excitación utilizada se Chroma Technology filtros D380/30x (380 + / – 30 nm) y D495/10 (495 + / – 5 nm), divisor se 505DCXR (505nm paso largo), y la emisión de filtro se HQ535/50m (535 + / – 25 nm). Nuestro microscopio usado para adquirir las imágenes en la Figura 1 se compone de una Nikon TE2000 microscopio invertido equipado con un Roper Científico Coolsnap HQ enfriado cámara CCD, Ludl MAC6000 rápida rueda de filtros y un cambiador, y una adquisición de datos MetaFluor y software de análisis. Este protocolo se puede adaptar a cualquier punto de vista amplio campo del microscopio con los filtros apropiados y software capaz de capturar y procesar imágenes radiométrica. Configurar el software para la excitación de doble uso de los 495 nm y 380 filtros. Unión del calcio a pericam radiométrica aumenta la absorbencia a 495 nm, con lo que la relación debe ser configurado para ser 495 nm/380 nm. Radiométrica pericam tiene un libre de calcio pico de excitación a 415 nm 4. En este protocolo le sugerimos que utilice un filtro de 380 nm sólo porque es omnipresente en la mayoría de los laboratorios de imagen de calcio. Si un filtro de 410 nm está disponible, es preferible que el filtro de 380 nm. Adquirir imágenes secuencialmente como alternativa interesante a 495 y 380 nm. Adquirir imágenes de los niveles de calcio de referencia por lo menos 30 s antes de la aplicación de agonistas a través de un aparato de perfusión. Además de marcar el tiempo para cada agonista. Los tiempos de exposición y los intervalos de adquisición debe ser optimizado para evitar photobleaching al tiempo que permite suficiente ejemplo resolution.For temporal, para la dinámica de calcio semi-rápido seguimiento en respuesta a la estimulación agonista, las imágenes fueron adquiridas cada dos segundos en las figuras 1B y C. Mucho más rápido las tasas de adquisición También es posible 6. A largo plazo después de la administración de imágenes estaurosporina fue adquirida con un intervalo más largo (30 años) entre las adquisiciones (Figuras 1 D y E). 3. Procesamiento de imágenes y análisis Una vez que el experimento está completo, las imágenes obtenidas pueden ser analizados fuera de línea. Definir regiones de interés (ROI) en la que desea monitorear los cambios en los niveles de calcio. Utilice un retorno de la inversión seleccionados dentro de un área vacía del campo para restar el fondo si es necesario. Cabe señalar que las mitocondrias son muy móviles y dinámicas, y la extrapolación de los acontecimientos en una sola mitocondria durante largos períodos de tiempo no siempre es posible. Por lo tanto, teniendo en cuenta la movilidad de alta de este orgánulo en algunos tipos de células, la selección de retorno de la inversión deben ser monitoreados cuidadosamente. Además, como se evidencia en la Figura 1, la respuesta de las mitocondrias heterogénea a diversos estímulos. Por tanto, es importante analizar los datos en línea y monitorear RO1 colocación en un fotograma a fotograma. Una descripción detallada de la medición de calcio mitocondrial en la mitocondria muy móviles ha sido descrito en otra parte 7. Obtuvieron mediciones de la relación de retorno de la inversión se pueden importar en Excel o similar graphingsoftware. Los datos pueden ser presentados como una huella que representan los cambios en los niveles de calcio mitocondrial en una sola celda o mitocondria sola, o un promedio de flseñales de fluorescencia de retorno de la inversión de varios. También hemos utilizado esta técnica para medir los niveles promedio de calcio mitocondrial en una población de linfocitos en la apoptosis inducida por Fas ligando 8. 4. Los resultados representativos: Figura 1. (A) la localización subcelular de radiométrica-pericam-mt. Esta primera imagen muestra en vivo de células HeLa que expresan radiométrica-pericam-mt. La segunda imagen muestra la tinción fluorescente selectiva mitocondria-dye MitoTracker CMXRos Roja. La fluorescencia de color amarillo en la imagen fusionada demuestra co-localización de radiométrica-pericam-mt y fluorescencia MitoTracker. (B) una serie de relación pseudocolor (495:380 nm) imágenes de 4 células HeLa que expresan mt-radiométrica pericam tratados con 10 mM ATP . (C) Cuantificación de los cambios en los niveles de calcio mitocondrial en la región de interés (ROI) se indica en (B) tratados con 10 mM ATP. (D) de la serie de la relación de pseudocolor (495:380 nm) imágenes de una célula HeLa expresar mt -radiométrica pericam tratados con estaurosporina M 0.5. Heterogeneidad en la respuesta de calcio en las mitocondrias individuales es evidente, así como una fragmentación significativa de las mitocondrias en 60 minutos. Algunos mitocondrias aumenta oscilatorio en calcio (cabeza de flecha blanca), mientras que otros no muestran cambios significativos en el nivel de calcio (cabeza de flecha amarilla). (E) Cuantificación de los incrementos en los niveles globales de calcio mitocondrial en una sola célula HeLa después de la inducción de la apoptosis con 0,5 M estaurosporina.