Monitoraggio Cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale durante l'apoptosi mediante un sensore di calcio geneticamente codificato

1. Pericam-mt Transfection e preparazione delle cellule. Piastra di cellule HeLa la notte prima di transfezione su vetrini sterili di vetro posta in una standard a 6 e piastra di coltura. Preparare DNA / Lipofectamine 2000 complessi come suggerito dal produttore (Invitrogen). Noi usiamo 4 microgrammi di raziometrici-pericam-mt vettore di espressione e 10 L del 2000 Lipofectamine diluito in 0,5 ml di Opti-MEM per ogni bene. Le cellule devono essere confluenti ~ 70% prima della trasfezione. Sostituire HeLa cultura dei media (Dulbecco modificato aquile medio, 10% FBS, penicillina / streptomicina) in ogni pozzetto con 1.5 mL degli stessi media senza antibiotici. Aggiungere il DNA / Lipofectamine complessi in ciascun pozzetto di essere transfettate. Mescolare delicatamente con dondolo e incubare per 4 ore in una cella cultura incubatore a 37 ° C, 5% di CO 2. Sostituire antibiotico-media liberi, con terreni di coltura con gli antibiotici. Consentono alle cellule di esprimere pericam raziometriche per 1-2 giorni prima di imaging. 2. Microscopio installazione e acquisizione immagini Posizionare un vetrino con cellule HeLa in una camera per immagini con una soluzione di imaging: 107mm NaCl, KCl 7,2 mm, 1,2 mm MgCl 2, 1 mM CaCl 2, 11,5 mm di glucosio, 0,1% di albumina di siero bovino, e HEPES 20 mM 7.2. Il nostro laboratorio utilizza la camera di cellule Attofluor da Invitrogen. Montare la camera di imaging in una fase microscopio invertito. Trova una zona di interesse contenente una o più cellule che esprimono pericam raziometrico con un 40x (o superiore) obiettivo ad immersione olio. Abbiamo scoperto che pericam raziometrico è meno resistente di photobleaching a 380 nm, e quindi usiamo questa lunghezza d'onda per identificare le cellule adatte. Per le immagini acquisite in Figura 1, un obiettivo Nikon Superfluor 40X con apertura 1,3 numerica è stata utilizzata. Obiettivi ingrandimento superiore Sarebbe anche opportuno (60-100x). I filtri utilizzati sono stati di eccitazione Chroma Tecnologia filtri D380/30x (380 + / – 30 nm) e D495/10 (495 + / – 5 nm), è stata beamsplitter 505DCXR (505nm longpass), ed emissioni filtro è stato HQ535/50m (535 + / – 25 nm). Il nostro microscopio utilizzato per acquisire le immagini in figura 1 è costituito da un microscopio invertito Nikon TE2000 dotato di un Roper Scientific Coolsnap HQ raffreddato CCD, Ludl MAC6000 rapido ruota portafiltri e cambio, e un MetaFluor acquisizione dati e software di analisi. Questo protocollo può essere adattato a qualsiasi standard a grande campo microscopio con i filtri appropriati e software in grado di catturare ed elaborare le immagini raziometrico. Impostare il software per l'eccitazione doppia utilizzando il 495 e 380 nm filtri. Calcio legame pericam raziometrici aumenta assorbanza a 495 nm, quindi il rapporto dovrebbe essere impostato per essere nm/380 495 nm. Raziometrico pericam ha un calcio senza picco di eccitazione a 415 nm 4. In questo protocollo si consiglia utilizzando un filtro da 380 nm solo perché è onnipresente nei laboratori più calcio di imaging. Se un filtro a 410 nm è disponibile, è preferibile il filtro 380 nm. Acquisire immagini in sequenza alternativamente emozionante a 495 e 380 nm. Acquisire immagini al basale dei livelli di calcio per almeno 30 s prima di applicare agonista tramite un apparato di perfusione. Segnano il tempo più di ogni agonista. Tempi di esposizione e gli intervalli di acquisizione deve essere ottimizzata per evitare photobleaching pur consentendo sufficiente esempio temporale resolution.For, per semi-rapida dinamica di calcio monitorati in risposta alla stimolazione con agonisti, immagini sono state acquisite ogni due secondi in 1B Figure e C. Molto più veloce tasso di acquisizione Sono possibili anche 6. A lungo termine dopo la somministrazione di imaging staurosporina è stata acquisita con un intervallo più lungo (30 anni) tra le acquisizioni (Figure 1 D ed E). 3. Image Processing and Analysis Una volta che l'esperimento è completo, le immagini ottenute possono essere analizzati in linea. Definire le aree di interesse (ROI) in cui si desidera monitorare i cambiamenti dei livelli di calcio. Utilizzare un ROI selezionate all'interno di una zona vuota del campo per sottrarre sfondo, se necessario. Va notato che i mitocondri sono molto mobili e dinamiche, e gli eventi in un mitocondrio estrapolando solo per lunghi periodi non è sempre possibile. Così, considerando l'elevata motilità di questo organello in alcuni tipi di cellule, la selezione di ROI deve essere attentamente monitorato. Inoltre, come evidenziato in Figura 1, i mitocondri eterogeneo risposta a vari stimoli. E 'quindi importante analizzare e monitorare i dati offline RO1 posizionamento su un fotogramma per fotogramma. Una descrizione dettagliata di misurare calcio mitocondriale altamente mobili mitocondri è stata descritta in altri 7. Misure di rapporto ottenuto dal ROI possono essere importati in Excel o simili graphingsoftware. I dati possono essere presentati come una traccia che rappresenta i cambiamenti dei livelli di calcio mitocondriale in una singola cella o mitocondrio singola, o una media di flsegnali uorescence dal ROI diversi. Abbiamo anche usato questa tecnica per misurare i livelli medi di calcio mitocondriale in una popolazione di linfociti in fase di apoptosi indotta da Fas ligando 8. 4. Rappresentante dei risultati: Figura 1. (A) la localizzazione subcellulare di raziometrici-pericam-mt. Questa prima immagine mostra dal vivo di cellule HeLa che esprimono raziometrico-pericam-mt. La seconda immagine mostra colorazione fluorescente con mitocondrio selettivi CMXRos MitoTracker colorante rosso. La fluorescenza giallo nell'immagine fusa dimostra co-localizzazione di raziometrici-pericam-mt e fluorescenza MitoTracker. (B) Una serie di pseudocolori rapporto (495:380 nm) immagini di 4 cellule HeLa che esprimono mt-raziometrico pericam trattati con 10 mM ATP . (C) Quantificazione dei cambiamenti nei livelli di calcio mitocondriale nella regione di interesse (ROI) di cui (B) trattati con 10 mM ATP. (D) Serie di rapporto pseudocolori (495:380 nm) le immagini di una cellula HeLa che esprimono mt -raziometrico pericam trattati con 0,5 staurosporina micron. L'eterogeneità nella risposta di calcio nei mitocondri individuale è evidente, così come notevole frammentazione dei mitocondri di 60 minuti. Alcuni hanno mitocondri aumenta oscillatorio di calcio (punta di freccia bianca), mentre altri non mostrano variazioni significative nel livello di calcio (testa freccia gialla). (E) Quantificazione di aumenti dei livelli globali di calcio mitocondriale in una singola cellula HeLa dopo l'induzione di apoptosi con 0,5 mM staurosporina.