رصد التغيرات الدينامية في مستويات الكالسيوم الميتوكوندريا خلال موت الخلايا المبرمج باستخدام جهاز استشعار الكالسيوم مشفرة وراثيا
Summary
يصف هذا بروتوكول طريقة لقياس الوقت الحقيقي لتدفقات الكالسيوم الميتوكوندريا بواسطة التصوير الفلورسنت. الأسلوب يستفيد من permutated دائري YFP المستندة إلى الاستشعار الكالسيوم ثنائي الإثارة ratiometric (ratiometric pericam – طن متري) : أعرب عن انتقائية في الميتوكوندريا.
Abstract
التغيرات الدينامية في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا استجابة لمختلف المحفزات ينظم العديد من العمليات الخلوية مثل انتشار الأسلحة النووية ، والتمايز ، وموت الخلايا المبرمج 1. موت الخلايا المبرمج خلال تراكم الكالسيوم في الميتوكوندريا يعزز الافراج عن أفكارك العوامل المؤيدة للمن الميتوكوندريا في العصارة الخلوية 2. لذلك فإنه من مصلحة مباشرة لقياس الكالسيوم الميتوكوندريا في الخلايا الحية في الموقع خلال موت الخلايا المبرمج. وقد ثبت عالية الدقة التصوير الفلورية لخلايا محملة المزدوجة وعدم إثارة ratiometric ratiometric الأصباغ الاصطناعية مؤشر الكالسيوم ليكون أداة موثوقة ومرنة لدراسة مختلف جوانب إشارات الكالسيوم داخل الخلايا. قياس تدفقات الكالسيوم عصاري خلوي استخدام هذه التقنيات واضحة نسبيا. ومع ذلك ، وقياس مستويات الكالسيوم في الخلايا intramitochondrial سليمة باستخدام مؤشرات مثل الكالسيوم الاصطناعية rhod – 2 و FF – rhod هو أكثر تحديا. لقد أضعفت المؤشرات الاصطناعية التي تستهدف الميتوكوندريا الردود على الزيادات المتكررة في الكالسيوم الميتوكوندريا ، وتعطيل مورفولوجيا الميتوكوندريا 3. بالإضافة إلى ذلك ، فإن المؤشرات تميل إلى تسرب الاصطناعية من أصل أكثر من الميتوكوندريا عدة ساعات مما يجعلها غير صالحة للتجارب طويلة الأمد. وبالتالي ، فقد سهلت المؤشرات الكالسيوم المرمزة وراثيا على أساس الفلورية الخضراء 4 (GFP) أو البروتين aequorin 5 الميتوكوندريا التي تستهدف بشكل كبير قياس الكالسيوم ديناميات الميتوكوندريا. هنا ، نحن تصف طريقة بسيطة لقياس الوقت الحقيقي لتدفقات الكالسيوم الميتوكوندريا استجابة لمحفزات مختلفة. يستند هذا الأسلوب على المجهري مضان من 'pericam – ratiometric" التي تستهدف بشكل انتقائي للالميتوكوندريا. pericam Ratiometric الكالسيوم هو مؤشر على أساس مزيج من بروتين فلوري permuted دائري الصفراء وكالمودولين 4. من الكالسيوم لملزم pericam ratiometric أسباب تحول في ذروة الإثارة والخمسين من 415 نانومتر إلى 494 نانومتر ، في حين أن الطيف الانبعاثات ، والتي تصل ذروتها حوالي 515 نانومتر ، لا تزال دون تغيير. Ratiometric pericam يربط أيون الكالسيوم واحد مع التفكك المستمر في المختبر من 1.7 ميكرومتر ~ 4. هذه الخصائص تسمح للpericam ratiometric القياس الكمي للتغيرات السريعة والطويلة الأجل في تركيز الكالسيوم الميتوكوندريا. وعلاوة على ذلك ، ونحن تصف تكييف هذه المنهجية في مستوى الكالسيوم واسعة حقل التصوير المجهر مع مجموعات التصفية المتاحة عموما. باستخدام اثنين من منبهات متميزة ، وpurinergic ATP ناهض وموت الخلايا المبرمج الذي يحفز staurosporine المخدرات ، وعلينا أن نظهر أن هذا الأسلوب مناسب لرصد التغيرات في تركيز الكالسيوم الميتوكوندريا مع القرار الزماني للثانية لساعات. وعلاوة على ذلك ، ونحن أيضا أن تثبت أن pericam ratiometric مفيد أيضا لقياس الانشطار الميتوكوندريا / التجزئة خلال موت الخلايا المبرمج. وبالتالي ، هو مناسبة بشكل خاص لقياس pericam ratiometric على المدى الطويل المستمر من خلال ديناميات الكالسيوم الميتوكوندريا موت الخلايا المبرمج.
Protocol
Discussion
نقدم هنا طريقة بسيطة جدا لقياس الكالسيوم الميتوكوندريا الميتوكوندريا باستخدام استهداف pericam ratiometric. كما هو مبين في الشكل 1A ، وذلك باستخدام معيار widefield البصريات مع عدم وجود deconvolution أنه من الممكن بسهولة عرض الميتوكوندريا الفردية في خلايا هيلا مع نسبة الإشارة إلى الضجيج مقبول. وذلك لأن خلايا هيلا ، مثل معظم الخلايا في الثقافة ، وتتسطح الى حد كبير عندما ملتصق تفادي الحاجة للفحص المجهري مبائر أو المعدات المتخصصة الأخرى. لقد تم العثور على نتائج مماثلة في الخلايا Jurkat التمسك بولي يسين coverslips المغلفة 8. على النقيض من منهجيات تستخدم الأصباغ ، فمن الممكن أيضا غير جراحية رصد مستويات الكالسيوم الميتوكوندريا لساعات باستخدام مؤشرات الكالسيوم المرمزة وراثيا مثل pericam ratiometric (الشكل 1E). هذا مهم خصوصا عند تحليل الكالسيوم خلال الميتوكوندريا موت الخلية. وعلاوة على ذلك ، فمن الممكن أيضا تصور الانشطار / تجزئة الميتوكوندريا أثناء عملية أفكارك. كما هو مبين في 1D الأرقام والبريد ، ومعالجة الأسباب staurosporine زيادة بطيئة في الكالسيوم في مجموعات سكانية فرعية مختارة من القمم التي الميتوكوندريا في 20 دقيقة. مستويات الكالسيوم تنخفض مرة أخرى مع ما يصاحب ذلك التشرذم الميتوكوندريا قبل الصعود مرة أخرى 2 ساعة بعد تلقي العلاج. وهذا يتفق مع موجات بطيئة في عصاري خلوي الكالسيوم الناجم عن العلاج staurosporine قياسها باستخدام Fura – 2 9. وبالتالي ، يمكن الحصول على معلومات الحركية الهامة التي لا يمكن لأساليب توظيف قياسات ثابتة. على الرغم من أننا قد قدمت نسب تركيزات الكالسيوم وليس في الشكل (1) ، فمن الممكن لمعايرة أجهزة الاستشعار في الموقع لحساب مستويات الكالسيوم المطلق 4 و 10. توضيح هام واحد للنظر هو أن pericam ratiometric حساسة لدرجة الحموضة 4 و 10. لأن كلا من مستويات الحموضة عصاري خلوي والميتوكوندريا يمكن أن تتغير بشكل كبير خلال 11 موت الخلايا المبرمج ، وهذا هو أحد الاعتبارات الهامة. معايرة درجة الحموضة في pericam الميتوكوندريا المعزولة معربا عن إثبات أن زيادة [H +] زيادة انبعاث pericam عندما متحمس في 495 نانومتر ، مع تأثير ضئيل على الانبعاث المستحث بواسطة الإثارة عند 410 نانومتر ، وهي الخاصية التي تم استغلالها في وقت واحد لقياس كل من الكالسيوم والميتوكوندريا الحموضة 12. وهكذا ، ورصد الانبعاثات بشكل انتقائي مع الإثارة 410 نانومتر يوفر وسيلة لرصد الكالسيوم غير ratiometrically الميتوكوندريا مع القلق انخفاض لدرجة الحموضة. أخيرا ، وبروتوكول المعروضة هنا لا يتطلب سوى الحصول على مجهر epifluorescent القياسية مع المرشحات على نطاق واسع ، مما يجعل هذه التقنية في متناول معظم المختبرات.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر اتسوشي Miyawaki لتزويدنا بناء التعبير ratiometric – pericam – طن متري. وأيد هذا العمل عن طريق منح GM081685 من المعاهد الوطنية للصحة (DB).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. | |
| Imaging Software | Molecular Devices, Inc | Metafluor | ||
| Attofluor cell chamber | Invitrogen Corporation | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Corporation | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies | |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen Corporation | M7512 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Hajnoczky, G. Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis. Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Miyawaki, A. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Shimozono, S. Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein. Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).
- Wozniak, A. L. Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis. J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).
- Boehning, D. Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).
- Csordas, G. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
- Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
