Überwachung dynamischen Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium während der Apoptose mit einem genetisch kodierten Kalzium-Sensor
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Echtzeit-Messung der mitochondrialen Kalzium-Flüsse durch Fluoreszenz-Imaging. Das Verfahren nutzt ein zirkular permutiert YFP-basierte Dual-Anregung ratiometrische Calcium-Sensor (ratiometrisch PERICAM-mt) selektiv in den Mitochondrien zum Ausdruck gebracht.
Abstract
Dynamische Veränderungen der intrazellulären Calcium-Konzentration als Reaktion auf verschiedene Reize reguliert viele zelluläre Prozesse wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose 1. Während der Apoptose, Kalzium Akkumulation in den Mitochondrien fördert die Freisetzung von pro-apoptotischen Faktoren aus den Mitochondrien ins Cytosol 2. Es ist daher von Interesse direkt zu messen mitochondriale Kalzium in lebenden Zellen in situ während der Apoptose. Hochauflösende Fluoreszenz-Bildgebung von Zellen mit Dual-Anregung ratiometrische und nicht ratiometrisch synthetische Calcium-Indikator-Farbstoffen beladen ist nachgewiesen worden, ein zuverlässiges und vielseitiges Werkzeug, um verschiedene Aspekte des intrazellulären Calcium-Signalgebung zu studieren. Mess-cytosolische Calcium Flüsse mit diesen Techniken ist relativ einfach. Die Messung intramitochondrialem Kalziumspiegel in intakten Zellen mit synthetischen Calcium-Indikatoren wie rhod-2 und rhod-FF ist eine größere Herausforderung. Synthetische Indikatoren gezielt an die Mitochondrien haben Antworten auf wiederkehrende Anstieg der mitochondrialen Kalzium-abgestumpft, und stören Mitochondrienmorphologie 3. Zudem neigen synthetische Indikatoren ein Austreten aus den Mitochondrien über mehrere Stunden, die sie ungeeignet für langfristige Experimente macht. So haben genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren auf grün fluoreszierende Protein (GFP) 4 oder 5 Aequorin gezielt an die Mitochondrien basiert stark Messung des mitochondrialen Kalzium Dynamik erleichtert. Hier beschreiben wir eine einfache Methode zur Echtzeit-Messung der mitochondrialen Kalzium-Flüsse in Reaktion auf verschiedene Reize. Die Methode basiert auf der Fluoreszenzmikroskopie von "ratiometrische-PERICAM", die selektiv an die Mitochondrien ist gezielt auf. Ratiometric PERICAM ist ein Kalzium-Indikator auf eine Verschmelzung von zirkular permutiert gelb fluoreszierendes Protein Calmodulin und 4 basiert. Die Bindung von Kalzium zu ratiometrische PERICAM bewirkt eine Verschiebung der Anregungs-Spitzenwert von 415 nm bis 494 nm, während das Emissionsspektrum, die Gipfel rund um 515 nm, bleibt unverändert. Ratiometric PERICAM bindet ein einzelnes Kalzium-Ionen mit einer Dissoziationskonstante in vitro von ~ 1,7 uM 4. Diese Eigenschaften der ratiometrische PERICAM erlauben die Quantifizierung der schnelle und langfristige Veränderungen in der mitochondrialen Kalzium-Konzentration. Darüber hinaus beschreiben wir die Anpassung dieser Methode auf einem Standard-wide-field Kalzium-Imaging-Mikroskop mit gängigen Filter-Sets. Mit zwei verschiedenen Agonisten, die purinergen Agonisten ATP und Apoptose-induzierenden Medikamenten Staurosporin zeigen wir, dass diese Methode geeignet zur Überwachung von Änderungen in der mitochondrialen Kalzium-Konzentration mit einer zeitlichen Auflösung von Sekunden bis Stunden. Darüber hinaus haben wir auch zeigen, dass ratiometrische PERICAM ist auch nützlich für die Messung mitochondrialen Spaltung / Fragmentierung während der Apoptose. So ist ratiometrisch PERICAM besonders gut für die langfristige, kontinuierliche Messung des mitochondrialen Kalzium-Dynamik während der Apoptose geeignet.
Protocol
Discussion
Hier präsentieren wir Ihnen eine sehr einfache Methode zur Messung der mitochondrialen Kalzium mittels mitochondrialer gezielte ratiometrische PERICAM. Wie in Abbildung 1A dargestellt, mit Standard-Weitfeld-Optik ohne Dekonvolution ist es möglich, problemlos anzeigen einzelnen Mitochondrien in HeLa-Zellen mit akzeptablen Signal-Rausch-Verhältnis. Dies liegt daran, HeLa-Zellen, wie die meisten Zellen in Kultur, verflachen sich deutlich, wenn Anhänger wodurch der Bedarf für die konfokale Mikroskopie oder andere Spezialausrüstung. Wir haben ähnliche Ergebnisse in Jurkat-Zellen eingehalten Poly-Lysin beschichteten Deckgläsern 8 gefunden. Im Gegensatz zu Methoden unter Verwendung von Farbstoffen, ist es auch möglich, nicht-invasiv zu überwachen mitochondriale Kalzium für Stunden mit genetisch kodierte Kalzium-Indikatoren wie ratiometrische PERICAM (Abb. 1E). Dies ist besonders wichtig bei der Analyse von mitochondrialen Kalzium während Zelltod. Darüber hinaus ist es auch möglich, Kernspaltung / Fragmentierung der Mitochondrien in den apoptotischen Prozess zu visualisieren. Wie in Abbildung 1D-und E dargestellt, Ursachen Staurosporin-Behandlung eine langsame Zunahme an Kalzium in ausgewählten Subpopulationen von Mitochondrien, die Peaks bei 20 Minuten. Kalziumspiegel wieder hinunter mit mitochondrialen Fragmentierung gleichzeitige, bevor sie wieder 2 Stunden nach der Behandlung. Dies steht im Einklang mit den langsamen Wellen im cytosolischen Calciumkonzentration durch Staurosporin Behandlung gemessen mit Fura-2 9 induziert. So können wichtige kinetische Informationen erhalten, die nicht mit Methoden unter Verwendung von statischen Messungen möglich werden. Obwohl wir Verhältnisse und nicht Calciumkonzentrationen in Abbildung 1 dargestellt haben, ist es möglich, den Sensor in situ zu kalibrieren, um absolute Kalziumspiegel 4, 10 zu berechnen. Eine wichtige Einschränkung zu beachten ist, dass ratiometrische PERICAM empfindlich auf pH 4, 10 ist. Da beide zytosolischen und mitochondrialen pH-Werte dramatisch verändern können während der Apoptose 11, ist dies ein wichtiger Gesichtspunkt. Titration von pH-Wert im isolierten Mitochondrien Ausdruck PERICAM zeigen, dass steigende [H +] erhöht Emission von PERICAM, wenn bei 495 nm angeregt, mit wenig Wirkung auf die Emission durch Anregung bei 410 nm, eine Eigenschaft, die ausgenutzt worden ist, um gleichzeitig die beiden mitochondrialen Kalzium stimuliert und pH 12. So selektiv Monitoring-Emission mit 410 nm Anregung bietet die Möglichkeit, nicht-ratiometrisch Monitor mitochondriale Kalzium mit reduzierter Sorge für pH-Wert. Schließlich das Protokoll hier vorgestellten erfordert nur Zugang zu einem Standard-Epifluoreszenz-Mikroskop mit weithin verfügbaren Filter, wodurch diese Technik zugänglich meisten Labors.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten Atsushi Miyawaki für uns mit der ratiometrische-PERICAM-mt Expressionskonstrukt danken. Diese Arbeit wurde durch Grant GM081685 von den National Institutes of Health (DB) unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Inverted wide-field fluorescent calcium imaging microscope | Nikon | MEA53310 | Any wide-field inverted microscope equipped with 380 nm/495 nm excitation filters and appropriate longpass and emission filter can be easily adapted to use this protocol. | |
| Imaging Software | Molecular Devices, Inc | Metafluor | ||
| Attofluor cell chamber | Invitrogen Corporation | A-7816 | Any imaging chamber for an inverted microscope which allows perfusion would suffice. | |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen Corporation | 11668-019 | Most transfection reagents/protocols would be appropriate for these studies | |
| MitoTracker Red CMXRos | Invitrogen Corporation | M7512 |
References
- Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. The versatility and universality of calcium signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 1, 11-21 (2000).
- Hajnoczky, G. Mitochondrial calcium signalling and cell death: approaches for assessing the role of mitochondrial Ca2+ uptake in apoptosis. Cell Calcium. 40, 553-560 (2006).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 3197-3202 (2001).
- Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin. Nature. 358, 325-327 (1992).
- Miyawaki, A. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388, 882-887 (1997).
- Shimozono, S. Confocal imaging of subcellular Ca2+ concentrations using a dual-excitation ratiometric indicator based on green fluorescent protein. Sci STKE. , pl4-pl4 (2002).
- Wozniak, A. L. Requirement of biphasic calcium release from the endoplasmic reticulum for Fas-mediated apoptosis. J Cell Biol. 175, 709-714 (2006).
- Boehning, D. Cytochrome c binds to inositol (1,4,5) trisphosphate receptors, amplifying calcium-dependent apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 1051-1061 (2003).
- Csordas, G. Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface. Mol Cell. 39, 121-132 (2010).
- Matsuyama, S., Llopis, J., Deveraux, Q. L., Tsien, R. Y., Reed, J. C. Changes in intramitochondrial and cytosolic pH: early events that modulate caspase activation during apoptosis. Nat Cell Biol. 2, 318-325 (2000).
- Jiang, D., Zhao, L., Clapham, D. E. Genome-wide RNAi screen identifies Letm1 as a mitochondrial Ca2+/H+ antiporter. Science. 326, 144-147 (2009).
