遺伝的にコードされたカルシウムのセンサを用いたアポトーシス時のミトコンドリア内カルシウム濃度の動的変更の監視

1。 Pericam – MTのトランスフェクションと細胞調製。 標準の6ウェル培養プレートに入れ、滅菌ガラス製カバースリップ上にプレートのHeLa細胞トランスフェクションの前に夜。 メーカー（Invitrogen社）によって提案されたDNA /リポフェクトアミン2000複合体を準備します。我々は、レシオメトリック- pericam – MT発現ベクター4μgのと各ウェルのためのOpti – MEM 0.5mlに希釈したリポフェクタミン2000の10μLを使用してください。細胞はトランスフェクションの前に〜70％コンフルエントにする必要があります。 抗生物質なしで同じメディアを1.5 mLで各ウェルのHeLa細胞培養培地（ダルベッコ改変イーグル培地、10％FBS、ペニシリン/ストレプトマイシン）を交換してください。 DNA /トランスフェクトされる各ウェルにリポフェクタミン複合体を追加。 37℃、5％CO 2でインキュベーター内で4時間振盪インキュベートで軽く混ぜる。 抗生物質を培地に抗生物質を含まない培地を交換してください。細胞は、イメージングの前に1-2日間レシオメトリックpericamを表現す​​ることができます。 2。顕微鏡のセットアップと画像の取得 107mMのNaCl、7.2mMのKCl、さ1.2mmのMgCl 2、1mMのCaCl 2で 、11.5mMグルコース、0.1％ウシ血清アルブミン、および20mMのHEPES 7.2：イメージングソリューションで適切な画像処理室内にHeLa細胞をカバースリップを配置。我々の研究室は、InvitrogenからAttofluorセルチャンバーを使用しています。倒立顕微鏡のステージでのイメージングチャンバーをマウントします。 40倍（またはそれ以上）油浸対物レンズを使用して、レシオメトリックpericamを表現す​​る一つ以上の細胞を含む関心領域を見つける。我々は、レシオメトリックpericamは380 nmで光退色の少ない使用環境の良好であることを発見したため、我々は、適切なセルを識別するために、この波長を使用してください。図1で取得した画像については、1.3開口数とニコンSuperfluor 40X目的が使用されました。より高い倍率の目標でも（60〜100倍）が適切です。とD495/10（495 + / – 5 nmの） – 使用される励起フィルターはクロマテクノロジーフィルタD380/30x（30nmの380 + /）だった、ビームスプリッタは505DCXR（505nmロングパス）であり、発光フィルターはHQ535/50m（535 + / gであった。 – 25nmの）。 図1の画像を取得するために使用される私たちの顕微鏡は、ローパーサイエンティフィックCoolsnap HQはCCDカメラ、Ludl MAC6000急速なフィルターホイールとチェンジャー、およびMetaFluorデータ収集と解析ソフトウェアを冷却を装備したニコンTE2000倒立顕微鏡で構成されています。このプロトコルは、適切なフィルタとレシオメトリック画像をキャプチャし、処理することができるソフトウェアで、標準的な広視野顕微鏡に適合させることができます。 495および380nmのフィルターを用いて二重励起するためのソフトウェアをセットアップします。レシオメトリックpericamに結合カルシウムは495nmの吸光度を増加させる、従って比は495 nm/380 nmとするように設定する必要があります。 レシオメトリックpericamは、415 nmの4のカルシウムフリー励起ピークを持っています。このプロトコルでは、それはほとんどのカルシウムイメージングの研究室でユビキタスなので、唯一のフィルター380nmのを使用することをお勧めします。 410nmのフィルターが使用可能な場合、それは、380nmのフィルターに好適である。 495および380nmで連続してで交互に刺激的な画像を取得する。灌流装置を介してアゴニストのアプリケーションの前に少なくとも30秒間のベースラインのカルシウム濃度の画像を取得する。各アゴニストの添加時間をマークします。露光時間と取得間隔がまだ十分な時間的resolution.Forの例を可能にしながら退色を防止するために最適化されるべきである、アゴニスト刺激に応答して、監視半迅速なカルシウム動態のため、画像は図1BとCのはるかに高速アクイジションレートで2秒ごとに取得したまた、6可能です。スタウロスポリンの投与後の長期的なイメージングは​​、買収（図1 DとE）の間に長い間隔（30秒）で買収された。 3。画像処理と解析実験が完了したら、得られた画像は、オフラインで分析することができます。あなたがカルシウム濃度の変化を監視するには、関心領域（ROI）を定義します。必要に応じてバックグラウンドを減算するフィールドの空の領域内で選択されたROIを使用してください。それは、ミトコンドリアが非常に運動性および動的であり、長期間にわたって、単一のミトコンドリア内のイベントを外挿することは常に可能ではないことに注意する必要があります。このように、いくつかの細胞型におけるこのオルガネラの高い運動性を考慮し、ROIの選択は慎重に監視する必要があります。さらに、図1、様々な刺激に対する不均一にミトコンドリア応答で証明。データをオフラインで分析し、フレームごとにRO1の配置を監視することが重要です。非常に運動性のミトコンドリアでミトコンドリアのカルシウムを測定するの詳細な説明は別の場所で7に記載されています。 ROIから得られる比測定は、Excelまたは類似のgraphingsoftwareにインポートすることができます。データは、単一細胞または単一ミトコンドリアにおけるミトコンドリア内カルシウム濃度の変化を表すトレースとして表示、またはflを平均化することができます。複数のROIからuorescence信号。我々はまた、Fasリガンド8で誘導されるアポトーシスを起こしたリンパ球の集団における平均的なミトコンドリアのカルシウム濃度を測定するためにこのテクニックを使用している。 4。代表的な結果： 図1。レシオメトリック- pericam – MTの（A）細胞内局在。この最初のイメージは、レシオメトリック- pericam – mtを表現するライブHeLa細胞を示しています。番目のイメージはミトコンドリア選択性色素のMitoTrackerにより赤CMXRosと蛍光染色を示す。マージされた画像で黄色の蛍光は、レシオメトリック- pericam – MTおよびMitoTrackerの蛍光の共局在を示しています。（B）は、擬似カラーの比（495:380 nm）を10 mMのATPで処理MT -レシオメトリックpericamを表現する4 HeLa細胞の一連の画像（C）関心領域（ROI）のミトコンドリア内カルシウム濃度の変化の定量化は、擬似の比（495:380 nm）のmtを発現するHeLa細胞の画像の（B）10 mMのATPによる治療を受けた。（D）シリーズに示さレシオメトリックpericamは0.5μMスタウロスポリンで処理した。個々のミトコンドリアのカルシウム応答の不均一性は明らか、と同様に60分でミトコンドリアの重要な断片化です。他のカルシウムのレベルに著しい変動があった場合（黄色の矢印の頭を）表示されないのに対し、いくつかのミトコンドリアは、カルシウム（白い矢印の頭）の振動が増加している。とアポトーシスの誘導後に単一のHeLa細胞におけるグローバルミトコンドリア内カルシウム濃度の増加（E）定量0.5μMのスタウロスポリン。