В этой статье мы опишем идентификации адено-связанный вирус серотипа 3 (AAV3), как наиболее эффективный вектор для направления человеческих клеток рака печени.
Рекомбинантные векторы на основе непатогенных человека парвовирус, адено-ассоциированные вирусы 2 (AAV2) были разработаны и используются в настоящее время в ряде генной терапии клинических испытаний. В последнее время ряд дополнительных серотипов AAV также были изолированы, которые были показаны на выставке селективного ткани тропизм в различных мелких и крупных животных моделях 1. Из 10 наиболее часто используемых серотипов AAV, AAV3 на сегодняшний день является наименее эффективным в трансдукции клеток и тканей в лабораторных, так и в естественных условиях.
Однако, на наш недавно опубликованных исследований, мы зафиксировали, что AAV3 векторов преобразовывать человека рак печени – злокачественная опухоль печени (HB) и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) – клеточные линии, очень эффективно, потому что AAV3 использует человеческие гепатоцитов рецептор фактора роста, как сотовые корецептором для переплета и вступление в этих клетках 2,3.
В этой статье мы опишем шаги, необходимые для достижения высокой эффективности трансдукции клеток человека рак печени с помощью рекомбинантной AAV3 переносчиков гена-репортера. Использование рекомбинантных AAV3 переносчиков терапевтических генов в конечном итоге может привести к потенциальной генной терапии рака печени у человека.
Рекомбинантные векторы на основе непатогенных человека парвовирус, адено-связанный вирус (AAV) были разработаны и используются в настоящее время в ряде генной терапии клинических испытаний 5. Ранее, из 10 наиболее часто используемых серотипов AAV, трансдукции эффективность AAV3 векторов в целом, как сообщается, быть особенно низкими, как в пробирке и в естественных 1. Тем не менее, наши недавние наблюдения, что AAV3 векторов преобразовывать человека раковых клеток печени чрезвычайно хорошо, как это определено количественно с помощью проточной цитометрии 2, и что AAV3 использует человеческий фактор роста гепатоцитов рецепторов (hHGFR) в качестве со-клеточный рецептор для связывания и вступление в этих клетки 3, настоятельно рекомендуем селективные ткани тропизм AAV3 для человеческих клеток печени в целом, и человеческие клетки рака печени в частности. Однако, поскольку AAV3 векторов также преобразовывать нормальные человеческие гепатоциты эффективно 2, их потенциального использования в генной терапии рака применение в естественных условиях было бы негативное влияние. Одна из возможных стратегий, чтобы обойти эту потенциальную проблему предполагает транскрипционных таргетирования раковых клеток путем выявления генов продукт, который выборочно производства опухоли, но не нормальных гепатоцитов. Например, предыдущие исследования показали, что сывороточные уровни α-фетопротеин (АФП) используются в качестве специфического маркера для отслеживания присутствия, прогрессии, и / или повторение определенных видов рака печени, так как нормальных гепатоцитов в целом производит очень небольшое количество этого белка. В самом деле, мы использовали AAV3 векторов, содержащих промоутер AFP целевому экспрессии трансгена в клетках рака печени, но не в нормальных гепатоцитов 2, и исследования в настоящее время для проверки эффективности такого подхода в мышиной модели ксенотрансплантата рака печени. В нашем дополнительных исследований, мы заметили, что трансдукция эффективность различных серотипов векторов AAV может быть существенно увеличено путем сайт-направленного мутагенеза поверхности, подвергшихся воздействию остатков тирозина в вирусную капсиды 6-14. С 6 на 7 поверхности, подвергшихся воздействию тирозинов также сохраняется в AAV3, мы выполнили сайт-направленного мутагенеза этих остатков и отметил, что трансдукция эффективность тирозин-мутант AAV3 векторы существенно усиливается в человеческой печени, раковые клетки (неопубликованные данные). Исследования также в настоящее время для оценки безопасности и эффективности тирозин-мутант AAV3 векторов в модели мыши ксенотрансплантата для человека гепатобластомы и гепатоцеллюлярной карциномы, а в случае успеха, оптимальное тирозин-мутант векторов AAV3 серотипа может оказаться полезным для таргетинга печени человека рака для потенциальных генной терапии.
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим доктора. Р. Джуд Samulski и Сяо Сяо за их добрые дары рекомбинантный AAV3 и AAV-EGFP плазмиды, соответственно, и д-р Гейл Томлинсон для предоставления щедро Hep293TT клеток. Работа выполнена при частичной поддержке общественного здравоохранения Службы R01 предоставлять гранты HL-076 901, R01 HL-097 088, а P01 DK-058327 (Проект 1) из Национальных институтов здравоохранения (АС).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
---|---|---|---|---|
DMEM | Cellgro | 10-0170CM | ||
PEI | Polysciences | 23966 | ||
Benzonase | Novagen | 70664-3 | ||
HiTrap Q HP column | GE Healthcare | 17-1154-01 | ||
Salmon sperm DNA | Fisher | NC9753983 | ||
Iodixanol gradient | OptiPrep | 1114542 | ||
G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |