Высокоэффективные трансдукция клеток рака печени с помощью рекомбинантной адено-ассоциированные вирус серотипа 3 Вектора
Summary
В этой статье мы опишем идентификации адено-связанный вирус серотипа 3 (AAV3), как наиболее эффективный вектор для направления человеческих клеток рака печени.
Abstract
Рекомбинантные векторы на основе непатогенных человека парвовирус, адено-ассоциированные вирусы 2 (AAV2) были разработаны и используются в настоящее время в ряде генной терапии клинических испытаний. В последнее время ряд дополнительных серотипов AAV также были изолированы, которые были показаны на выставке селективного ткани тропизм в различных мелких и крупных животных моделях 1. Из 10 наиболее часто используемых серотипов AAV, AAV3 на сегодняшний день является наименее эффективным в трансдукции клеток и тканей в лабораторных, так и в естественных условиях.
Однако, на наш недавно опубликованных исследований, мы зафиксировали, что AAV3 векторов преобразовывать человека рак печени – злокачественная опухоль печени (HB) и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) – клеточные линии, очень эффективно, потому что AAV3 использует человеческие гепатоцитов рецептор фактора роста, как сотовые корецептором для переплета и вступление в этих клетках 2,3.
В этой статье мы опишем шаги, необходимые для достижения высокой эффективности трансдукции клеток человека рак печени с помощью рекомбинантной AAV3 переносчиков гена-репортера. Использование рекомбинантных AAV3 переносчиков терапевтических генов в конечном итоге может привести к потенциальной генной терапии рака печени у человека.
Protocol
Discussion
Рекомбинантные векторы на основе непатогенных человека парвовирус, адено-связанный вирус (AAV) были разработаны и используются в настоящее время в ряде генной терапии клинических испытаний 5. Ранее, из 10 наиболее часто используемых серотипов AAV, трансдукции эффективность AAV3 векторов в целом, как сообщается, быть особенно низкими, как в пробирке и в естественных 1. Тем не менее, наши недавние наблюдения, что AAV3 векторов преобразовывать человека раковых клеток печени чрезвычайно хорошо, как это определено количественно с помощью проточной цитометрии 2, и что AAV3 использует человеческий фактор роста гепатоцитов рецепторов (hHGFR) в качестве со-клеточный рецептор для связывания и вступление в этих клетки 3, настоятельно рекомендуем селективные ткани тропизм AAV3 для человеческих клеток печени в целом, и человеческие клетки рака печени в частности. Однако, поскольку AAV3 векторов также преобразовывать нормальные человеческие гепатоциты эффективно 2, их потенциального использования в генной терапии рака применение в естественных условиях было бы негативное влияние. Одна из возможных стратегий, чтобы обойти эту потенциальную проблему предполагает транскрипционных таргетирования раковых клеток путем выявления генов продукт, который выборочно производства опухоли, но не нормальных гепатоцитов. Например, предыдущие исследования показали, что сывороточные уровни α-фетопротеин (АФП) используются в качестве специфического маркера для отслеживания присутствия, прогрессии, и / или повторение определенных видов рака печени, так как нормальных гепатоцитов в целом производит очень небольшое количество этого белка. В самом деле, мы использовали AAV3 векторов, содержащих промоутер AFP целевому экспрессии трансгена в клетках рака печени, но не в нормальных гепатоцитов 2, и исследования в настоящее время для проверки эффективности такого подхода в мышиной модели ксенотрансплантата рака печени. В нашем дополнительных исследований, мы заметили, что трансдукция эффективность различных серотипов векторов AAV может быть существенно увеличено путем сайт-направленного мутагенеза поверхности, подвергшихся воздействию остатков тирозина в вирусную капсиды 6-14. С 6 на 7 поверхности, подвергшихся воздействию тирозинов также сохраняется в AAV3, мы выполнили сайт-направленного мутагенеза этих остатков и отметил, что трансдукция эффективность тирозин-мутант AAV3 векторы существенно усиливается в человеческой печени, раковые клетки (неопубликованные данные). Исследования также в настоящее время для оценки безопасности и эффективности тирозин-мутант AAV3 векторов в модели мыши ксенотрансплантата для человека гепатобластомы и гепатоцеллюлярной карциномы, а в случае успеха, оптимальное тирозин-мутант векторов AAV3 серотипа может оказаться полезным для таргетинга печени человека рака для потенциальных генной терапии.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора. Р. Джуд Samulski и Сяо Сяо за их добрые дары рекомбинантный AAV3 и AAV-EGFP плазмиды, соответственно, и д-р Гейл Томлинсон для предоставления щедро Hep293TT клеток. Работа выполнена при частичной поддержке общественного здравоохранения Службы R01 предоставлять гранты HL-076 901, R01 HL-097 088, а P01 DK-058327 (Проект 1) из Национальных институтов здравоохранения (АС).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro | 10-0170CM | ||
| PEI | Polysciences | 23966 | ||
| Benzonase | Novagen | 70664-3 | ||
| HiTrap Q HP column | GE Healthcare | 17-1154-01 | ||
| Salmon sperm DNA | Fisher | NC9753983 | ||
| Iodixanol gradient | OptiPrep | 1114542 | ||
| G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |
References
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 16, 1073-1080 (2008).
- Glushakova, L. G., Lisankie, M. J., Eruslanov, E. B., Ojano-Dirain, C., Zolotukhin, I., Liu, C., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. AAV3-mediated transfer and expression of the pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit gene causes metabolic remodeling and apoptosis of human liver cancer cells. Mol Genet & Metabol. 98, 289-299 (2009).
- Ling, C., Lu, Y., Kalsi, J. K., Jayandharan, G. R., Li, B., Ma, W., Cheng, B., Gee, S. W., McGoogan, K. E., Govindasamy, L., Zhong, L., Agbandje-McKenna, M., Srivastava, A. Human hepatocyte growth factor receptor is a cellular coreceptor for adeno-associated virus serotype 3. Hum Gene Ther. 21, 1741-1747 (2010).
- Chen, T. T., Rakheja, D., Hung, J. Y., Hornsby, P. J., Tabaczewski, P., Malogolowkin, M., Feusner, J., Miskevich, F., Schultz, R., Tomlinson, G. E. Establishment and characterization of a cancer cell line derived from an aggressive childhood liver tumor. Pediatr Blood & Cancer. 53, 1040-1047 (2009).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Zhong, L., Li, B., Mah, C. S., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Cooper, M., Herzog, R. W., Zolotukhin, I., Warrington, K. H., Weigel-Van Aken, K. A., Hobbs, J. A., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A. Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 7827-7832 (2008).
- Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Min, S. H., Chiodo, V., Pang, J. J., Zhong, L., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. High-efficiency transduction of the mouse retina by tyrosine-mutant AAV serotype vectors. Mol Ther. 17, 463-471 (2009).
- Jayandharan, G. R., Zhong, L., Sack, B. K., Rivers, A. E., Li, M., Li, B., Herzog, R. W., Srivastava, A. Optimized adeno-associated virus (AAV)-protein phosphatase-5 helper viruses for efficient liver transduction by single-stranded AAV vectors: therapeutic expression of factor IX at reduced vector doses. Hum. Gene Ther. 21, 271-283 (2010).
- Li, M., Jayandharan, G. R., Li, B., Ling, C., Ma, W., Srivastava, A., Zhong, L. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21, 1527-1543 (2010).
- Kauss, M. A., Smith, L. J., Zhong, L., Srivastava, A., Wong, K. K. J. r., Chatterjee, S. Enhanced long-term transduction and multilineage engraftment of human hematopoietic stem cells transduced with tyrosine-modified recombinant adeno-associated virus serotype 2. Hum Gene Ther. 21, 1129-1136 (2010).
- Qiao, C., Zhang, W., Yuan, Z., Shin, J. H., Li, J., Jayandharan, G. R., Zhong, L., Srivastava, A., Xiao, X., Duan, D. Adeno-associated virus serotype 6 capsid tyrosine-to-phenylalanine mutations improve gene transfer to skeletal muscle. Hum Gene Ther. 21, 1343-1348 (2010).
- Markusic, D. M., Herzog, R. W., Aslanidi, G. V., Hoffman, B. E., Li, B., Li, M., Jayandharan, G. R., Ling, C., Zolotukhin, I., Ma, W., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Zhong, L. High-efficiency transduction and correction of murine hemophilia B using AAV2 vectors devoid of multiple surface-exposed tyrosines. Mol Ther. 18, 2048-2056 (2010).
- Ojano-Dirain, C., Glushakova, L. G., Zhong, L., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. An animal model of PDH deficiency using AAV8-siRNA vector-mediated knockdown of pyruvate dehydrogenase E1α. Mol Genet & Metabol. 101, 183-191 (2010).
- Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Deng, W. T., Pang, J. J., Min, S. H., Chiodo, V., Neeley, A. W., Govindasamy, L., Bennett, A., Agbandje-McKenna, M. Novel properties of tyrosine-mutant AAV2 vectors in the mouse retina. Mol Ther. , (2011).
