High-Efficiency transductie van leverkanker met behulp van recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 3 Vectoren

1. Verpakken van Recombinant adeno-geassocieerd virus serotype 3 (rAAV3) vectoren Ga naar de website: " http://www.geguchadze.com/calc "en berekent het bedrag van DNA. Pre-mix plasmiden pHelper (adenovirus helper), pACG2c3 (AAV helper) en pdsAAV-CB-EGFP (rAAV vector) in medium zonder FBS en antibiotica. Totale volume moet 8.750 ul voor tien 15 cm 2 platen worden. Voeg direct 1250 ul van PEI (0,1% m / v, Polysciences, Cat # 23966, pH 4,5) in de DNA-oplossing in stap 1.2. Vortex de DNA-PEI oplossing voor een paar seconden. Incubeer DNA-PEI oplossing voor een complex formulier voor 5 min bij kamertemperatuur (RT). Voeg 1 mL van DNA-PEI oplossing per 15 cm 2 plaat. Verwijder medium na 4 uur, te vervangen met vers 25 ml compleet medium +10% FBS (C-DMEM). Tweeënzeventig uur na transfectie, schrapen cellen en giet het in een 250 ml konische centrifugebuis. Draaien op 3000 rpm, bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Giet af supernatant. Resuspendeer de celpellet in 5 ml van de RB TMS buffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0). Transfer naar een nieuwe 15 ml conische buis. Freeze in droog ijs-ethanol bad gedurende 10 min en ontdooien bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Herhaal dit drie keer. Voeg 1 ul van 4,8 M MgCl 2 en 2 pi van Benzonase (25 U / uL, Novagen, Cat # 70.664-3). Vortex en incubeer bij 37 ° C gedurende 40 minuten. Spin down bij 4.000 toeren per minuut, bij 4 ° C gedurende 40 min en verzamel de supernatant (geklaarde lysaat). In een 13 mL Quick-Seal centrifugebuis (Beckman, Cat # 342413), load iodixanol gradiënt (OptiPrep, Cat # 1114542) van boven naar beneden: 2 ml van 15%, 2 ml van 25%, 1,5 ml van 40% en 1,5 ml van 60% iodixanol. Laad de supernatant (Stap 1.12) op de top van iodixanol verloop. Vul de buizen met RB TMS Buffer. Centrifugeer bij 75.000 rpm gedurende 1 uur bij 16 ° C met behulp van Beckman 90Ti rotor. Verzamel de 40% iodixanol fractie door het invoegen van een spuit op 40-60% grens. Breng de 40% iodixanol fractie in een 50 ml conische buis en tot 40 ml te maken met buffer A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5). Monteer de filtratie waarbij gebruik wordt gemaakt HiTrap Q HP kolom (GE Healthcare, Cat # 17-1154-01). Was de kolom met de volgende buffer: 25 ml buffer A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5), 25 ml buffer B (10 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8,5), 50 ml buffer A; 40 ml van het virus monster in Buffer A, 50 ml buffer A (20 mM Tris, 15 mM NaCl, pH 8,5), 20 ml buffer C (20 mM Tris, 175 mM NaCl, pH 8,5); Verzamel Buffer C in een 20 mL Apollo Concentrators (Orbital Biosciences). Centrifugeer bij 3.000 tpm, bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Gooi de doorstroming en voeg 20 ml koud PBS en centrifugeer bij 3.000 toeren per minuut, bij 4 ° C gedurende 10 minuten. Gooi de doorstroming en voeg 500 ul van gekoeld PBS. Was de vectoren af ​​van het membraan en overdracht aan siliconen behandeld Eppendorf buizen en op te slaan bevroren in kleine porties bij -80 ° C. 2. Bepaling van de rAAV3 Vector Titers Dooi 10 pi van gezuiverd virus in een Eppendorf buis op ijs. Voeg 40 ul van DDH 2 O. Voeg 0,2 ul van Benzonase (25 U / uL, Novagen, Cat # 70664) en incubeer bij 37 ° C gedurende 1 uur. Neem 50 ul van plasmide standaard (0.2 ng / ul) in een ander eppendorfbuisje. Voeg 50 ul van 100 mM NaOH in elke buis en incubeer in 65 ° C gedurende 30 minuten. Onmiddellijk Chill op ijs gedurende minstens 5 minuten. Snijd overdracht membraan (Millipore, Cat # INYC00010) volgens Bio-Dot Filter Paper (Bio-Rad, Cat # 1620161). Spoel membraan in 10x SSC met drie filter papieren voor 20 minuten. Stel slot blot SF Apparatuur (Bio-Dot, Cat # 170 tot 6.542). Verbinding maken met een vacuüm kolf en voeg 100 ul van 10x SSC tot slot blot apparatuur. Voeg 100 ul van 20x SSC en 1 pi van 6x laden kleurstof aan elk van de monsters in stap 2.5. Belasting 100 pi van elk monster op het membraan in de sleuf blot apparaat. Voeg nog een 100 ul van 10x SSC in elk van de monsters. Herhaal de stappen 2.9 en 2.10 tot alle monster gaat door het membraan. Demonteer de sleuf blot apparaat en verwijder het membraan. Zet het in de Inspector Linker SL-1000 UV Crosslinker. Schakel "Energie", "Optimaal Crosslink" (show 1200) en druk op "Start". Kook 1 ml zalmsperma (SS) DNA (Fisher, Cat # NC9753983) gedurende 5 minuten. Chill op ijs gedurende minstens 5 minuten. De voorbereiding van de pre-hybridisatie-oplossing door het mengen van 27,5 mL van DDH 2 O, 15 ml 20x SSC, 5 ml van de oplossing 50x Denhardt's, 1,25 ml 20% SDS, 0,25 ml polyA en 1 ml van SS DNA van stap 2.13. Hang de membraan in 25 ml van de pre-hybridisatie-oplossing in een bedekte glazen cilinder en incubeer bij 65 ° C in een hybridisatie kamer 's nachts. Verdunnen 50 ng DNA-sjablonen in 10 uL van DDH 2 O. Koken bij 100 ° C gedurende 5 min en chillen op het ijs onmiddellijk gedurende minstens 5 minuten. Centrifugeer bij 3.000 tpm bij RT gedurende 1 minuut. Voeg 2 ul van 10 mM 3 dNTPs (gebrek aan dCTP), 2 pi van Hexanucleotide Mix (Roche, Cat # 11277081001), 1 ul van Klenow (Roche, Cat # 11008404001) en 5 pi van α -32 P-dCTP. Incubeer bij 37 ° C gedurende 10 minuten. Centrifuge G-50 kolommen (GE Healthcare, Cat # 27-5330-01) bij 3.000 tpm gedurende 2 minuten. belasting de sonde in stap 2,17 in de kolom. Centrifugeer bij 3.000 tpm gedurende 2 min en het verzamelen van de doorstroming. Tellen radioactiviteit. Kook de sonde bij 100 ° C gedurende 5 min en chillen op het ijs onmiddellijk gedurende minstens 5 minuten. Voeg de sonde (6×10 5 cpm / ml) in de pre-hybridisatie-oplossing met een membraan. Incubeer overnacht bij 65 ° C in een hybridisatie kamer. Gooi de hybridisatie-oplossing en spoel het membraan in 2x SSC +0.1% SDS bij RT gedurende 15 minuten. Gooi de oplossing en spoel het membraan in 0.1x SSC +0.1% SDS bij 65 ° C gedurende 30 minuten. Gooi de oplossing en spoel het membraan in 0.1x SSC bij RT kort. Expose de film bij -80 ° C gedurende 6 uur en de ontwikkeling van de film. Een typisch resultaat is weergegeven in figuur 1. 3. rAAV3 Vector-gemedieerde transductie en Transgene expressie in menselijke lever kankercellen Zaad 1×10 4 cellen (ofwel Huh7 of Hep293TT) in elke well van de 96-well plaat. Incubeer in een bevochtigde CO 2 incubator voor ten minste 18 uur. Verwijder medium uit de 96-well plaat. Twee keer wassen cellen met 50 ul van medium zonder FBS en antibiotica en te verwijderen. Voeg 50 ul van medium zonder FBS en antibiotica en rAAV vectoren in 5000 VGS / cel. Incubeer de platen in de CO 2-incubator gedurende 4 uur. Gooi het medium. Twee keer wassen cellen met 50 ul van compleet medium en te verwijderen. Voeg 150 ul van C-DMEM aan elk putje en incubeer de plaat in CO 2 incubator gedurende 72 uur, en visualiseer de EGFP expressie met behulp van een fluorescentie microscoop (DMI 4000B, Leica Microsystems). Beelden uit de drie bronnen van virus-geïnfecteerde cellen worden kwantitatief geanalyseerd door ImageJ analyse software (NIH, Bethesda, MD, USA). Transgen expressie wordt beoordeeld als de totale oppervlakte van groene fluorescentie (pixel 2) per gezichtsveld. Een typisch resultaat is weergegeven in figuur 2. Transgen expressie kan ook worden bepaald door middel van flowcytometrie. 4. Representatieve resultaten: Naar aanleiding van het protocol hierboven beschreven, kan een efficiënt genereren AAV-serotype vectoren. De typische opbrengst is ~ 500 pi met ~ 10 11 VGS / ul van gezuiverde vector voorraad. De zuiverheid van de vector voorraad wordt bepaald door het vergelijken van hybridisatie signalen op kwantitatieve DNA slot blots, met en zonder Benzonase spijsvertering. Gezuiverd rAAV3 vectoren transduceren menselijke lever kanker – Hepatoblastoma (HB) en hepatocellulair carcinoom (HCC) – cellijnen efficiënt. Figuur 1. Kwantitatieve DNA slot-blot-analyse voor het bepalen van de titers van rAAV3 vectoren. Tweevoudige verdunningen van gezuiverde virale voorraden, verteerd met Benzonase (bovenste rij) werden geanalyseerd op kwantitatieve DNA slot blots met 32 P-gelabelde EGFP-specifieke DNA-probe. De titer van AAV3 vector werd bepaald door vergelijking met een ng (middelste rij) of 10 ng (onderste rij) van AAV-EGFP-plasmide normen geladen op het membraan. De nummers komen overeen met DNA-kopieën. Figuur 2. Recombinant AAV vector-gemedieerde transgen-expressie in menselijke leverkanker cellen. Hep293TT cellen, een recent opgericht menselijke Hepatoblastoma cellijn 4, werden ofwel mock-geïnfecteerde (linker paneel), of getransduceerd met 5000 VGS / cel van een van beide scAAV2-EGFP of scAAV3-EGFP vectoren bij 37 ° C gedurende 2 uur. Transgenexpressie werd gevisualiseerd 72 uur na transductie met behulp van een fluorescentie microscoop.