組換えアデノ随伴ウイルスの血清型3つのベクトルによる肝癌細胞の高効率形質導入

1。組換えアデノ随伴ウイルス3型（rAAV3）ベクターのパッケージングウェブサイトにアクセスしてください：" http://www.geguchadze.com/calc "とDNAの量を計算する。 FBSと抗生物質を含まない培地中でプレミックスプラスミドpHelper（アデノウイルスヘルパー）、pACG2c3（AAVヘルパー）とpdsAAV – CB – EGFP（するrAAVベクトル）。総量は10 15センチメートル2プレート用8750μLにする必要があります。 ステップ1.2のDNA溶液にPEIの1250μL（0.1％M / V、Polysciences、カタログ番号23966、pH4.5）を直接追加します。数秒間ボルテックスDNA – PEIのソリューション。 インキュベートDNA – PEIは、溶液を室温で5分（RT）のための複合体を形成する。 15センチメートル2板あたりのDNA – PEI溶液1mLを追加。 新鮮な25mLの完全培地+10％FBS（C – DMEM）に置き換えて、4時間後に培地を取り外します。 七十二時間後にトランスフェクション、スクレープ細胞と250 mLのコニカル遠心チューブに分注する。 4℃、3000rpmでスピン、℃で10分間。上清を捨て。 RB TMS緩衝液（50mMトリス- HCl、150mMのNaCl、pH8.0）を5mLに細胞ペレットを再懸濁する。新しい15 mLコニカルチューブに移す。 37℃で10分間解凍するためのドライアイス – エタノール浴で凍結℃で10分間。 3回繰り返します。 4.8 M MgCl 2とベンゾナーゼ2μL（25 U /μL、Novagen社、カタログ番号70664〜3）の1μLを追加。 37渦とインキュベート℃で40分間。 40分間4℃、4,000 rpmでCをスピンダウンして（ライセートを清澄化）上清を集める。 15％の2 mLの25％の2 mLの40％、1.5 mLおよび13 mLのクイックシールの遠心管（ベックマン、カタログ番号342413）、上から下への負荷イオジキサノール勾配（OptiPrep、カタログ番号1114542）で60％のイオジキサノール1.5mLの。イオジキサノール勾配の上清（ステップ1.12）ロードする。 RB TMS Bufferでチューブを埋める。 ° Cベックマン90Tiローターを使用して、16で1時間75000 rpmで遠心する。 40〜60％の境界で注射器を挿入することにより40％イオジキサノール画分を集める。 1つの50 mLコニカルチューブに40％のイオジキサノール分画を転送し、バッファーを40 mLのために構成する（20mMトリス、15mMのNaClを、pHは8.5）。 ハイトラップQ HPカラム（GE Healthcare社、カタログ番号17-1154-01）を使用してろ過装置を組み立てます。以下のバッファーでカラムを洗浄する：バッファーを25mL（20mMトリス、15mMのNaClを、pH 8.5）に、緩衝液B（10mMトリス、500mMのNaCl、pH 8.5）に25mLの、バッファー50 mLの。バッファ内のウイルスのサンプルを40 mLの、バッファー50 mLの（20mMトリス、15mMのNaClを、pH 8.5）に、緩衝液C（20mMトリス、175 mMのNaCl、pH 8.5）に20mLの。 20 mLのアポロコンセントレータ（オービタルサイエンス）のバッファCを収集する。 4℃、3,000 rpmで遠心する℃で10分間を。 フロースルーを捨て、4℃、3000rpmで冷却したPBSおよび遠心の20 mLを加え℃で10分間を。 フロースルーを捨て、冷却したPBS 500μLを加える。 -80小アリコートで凍結シリコン処理したエッペンドルフチュー​​ブとストアへの膜と転送℃からベクトルを洗い流す 2。 rAAV3ベクトルの力価の決定氷上でエッペンドルフチュー​​ブに精製ウイルスの10μLを解凍。のddH 2 Oの40μLを追加ベンゾナーゼの0.2μL（25 U /μL、Novagen社、カタログ番号70664）を追加し、37℃で1時間。 別のエッペンドルフチュー​​ブにプラスミド標準（0.2 ng /μLの）50μLを取る。 65の各チューブとインキュベート℃で30分間に100 mMのNaOHを50μLを追加。 少なくとも5分間、直ちに氷上で冷やします。 バイオドットろ紙（Bio – Rad社製、カタログ番号1620161）に応じて転写膜（ミリポア、カタログ番号INYC00010）をカット。 20分のための3つのフィルター紙で10 × SSCでメンブレンを洗浄します。 スロットブロットSF装置（バイオドット、猫＃170〜6542）を設定します。真空フラスコに接続し、スロットブロット装置に10倍のSSCの100μLを加える。 ステップ2.5のサンプルのそれぞれに20 × SSCの100μLおよび6xローディング色素の1μLを追加。 スロットブロット装置の膜上に各サンプル100μLをロードします。 サンプルの各々に10倍のSSCの別の100μLを加える。 すべてのサンプルがメンブレンを通過するまで、ステップ2.9および2.10を繰り返します。 スロットブロット装置を分解して膜を取り除く。インスペクタのリンカSL – 1000 UV架橋剤に入れて。 "エネルギー"、"最適な架橋"（ショー1200）の電源を入れ、"開始"を押す。 サケの精子の沸騰を1 mL（SS）DNA（フィッシャー、カタログ番号NC9753983）5分間。少なくとも5分間氷上で冷やします。 のddH 2 O、20 × SSC、50 ×デンハルト溶液、20％SDS、1.25 mLを、ポリA 0.25mLのとステップ2.13からSS DNAを1mLの5 mLの15 mLのの27.5 mLを混合してプレハイブリダイゼーション溶液を調製します。 65でキャップガラスシリンダーとインキュベートでプレハイブリダイゼーション溶液で一晩ハイブリダイゼーションチャンバーのCの25 mLの膜を一時停止する。 のddH 2 O10μlに50 ngの鋳型DNAを希釈する。 100℃沸騰℃で少なくとも5分間、直ちに氷上で5分間と寒さのため。 1分間、室温で3,000 rpmで遠心する。 10mMの3のdNTP（dCTPを欠いている）、ヘキサヌクレオチドミックスの2μL（Roche社、カタログ番号11277081001）、クレの1μL（Roche社、カタログ番号11008404001）とα-32 P – dCTPの5μLの2μLを加える。 37℃で10分間インキュベートする。 2分間、3,000 rpmでG – 50カラムを（GE Healthcare社、カタログ番号27-5330-01）心する。カラムにステップ2.17にプローブをロードする。 2分間、3,000 rpmで遠心し、フロースルーを収集する。 放射能をカウント。 ° C、直ちに氷上で5分間と寒さのために少なくとも5分間、100℃のプローブを沸騰。 膜とのプレハイブリダイゼーション溶液にプローブ（6 × 10 5 cpm / mlの）を追加します。 ハイブリダイゼーションチャンバーで65℃で一晩インキュベートする。 ハイブリダイゼーション溶液を捨て、15分間室温で2 × SSC 0.1パーセントSDSで膜をすすいでください。 液を捨て、℃で30分間65℃で0.1 × SSC 0.1パーセントSDSで膜をすすいでください。 液を捨て、室温で短時間で0.1 × SSCで膜をすすいでください。 6時間-80℃でフィルムを公開し、フィルムを開発する。典型的な結果を図1に示されています。 3。 rAAV3ベクターによる形質導入し、ヒト肝癌細胞における導入遺伝子発現 96ウェルプレートの各ウェル内のシード1 × 10 4細胞（したHuh7またはHep293TTのどちらか）。少なくとも18時間加湿CO 2インキュベーター内でインキュベートする。 96ウェルプレートから培地を取り除く。 FBSと抗生物質を含まない培地50μLで細胞を2回洗浄し、削除する。 5000 VGS /細胞でFBSと抗生物質とするrAAVベクターを含まない培地50μLを加える。 4時間CO 2インキュベーターで培養する。 培地を捨てる。完全培地50μLで細胞を2回洗浄し、削除します。 各ウェルに、C – DMEMを150μLを追加し、72時間CO 2インキュベーター内でプレートをインキュベートし、蛍光顕微鏡（DMI 4000B、ライカマイクロシステムズ）を用いてEGFPの発現を可視化する。 ウイルス感染細胞の3つのウエルからの画像は、ImageJの解析ソフト（NIH、ベセスダ、MD、米国）によって定量的に解析されています。 導入遺伝子の発現は、視野あたりの緑色蛍光の総面積（画素2）として評価される。典型的な結果を図2に示されています。 導入遺伝子の発現は、フローサイトメトリーによって決定することができる。 4。代表的な結果： 上記のプロトコルに続いて、一つは効率的にAAVの血清型のベクトルを生成することができます。典型的な収量は、ベクトルの株式を精製〜10 11 VGS /μLを含む〜500μLです。ベクトルの株式の純度は、ベンゾナーゼの消化がある場合とない場合の、定量的なDNAのスロットブロットでハイブリダイゼーションシグナルを比較することによって決定されます。効率的に細胞株 – 肝芽腫（HB）と肝細胞癌（HCC） – rAAV3ベクトル形質導入ヒト肝癌を精製。 図1。rAAV3ベクトルの力価を決定するための定量的DNAスロット-ブロット分析。ベンゾナーゼ（一番上の行）で消化し ​​たウイルス株を、精製の​​2倍希釈を32 P -標識したEGFP特異的DNAプローブを用いて定量的なDNAのスロットブロットで分析した。 AAV3ベクトルの力価は、1 ngの（中段）または膜にロードされたAAV – EGFPプラスミド基準の10ngの（一番下の行）との比較により決定した。数字は、DNAのコピーに対応しています。 図2組換えAAVヒト肝癌細胞におけるベクターによる導入遺伝子の発現。 Hep293TT細胞、最近設立されたヒト肝芽細胞の4行目は 、どちらかのモック感染（左パネル）だった、または2時間、37℃でscAAV2 – EGFPまたはscAAV3 – EGFPベクターのどちらかの5000 VGS /セルで形質導入。導入遺伝子の発現は72時間後の形質導入は、蛍光顕微鏡を用いて可視化した。