High-Efficiency Transduktion von Liver Cancer Cells von rekombinanten Adeno-assoziierten Virus Serotyp 3 Vektoren
Summary
In diesem Artikel beschreiben wir die Identifikation des Adeno-assoziierten Virus Serotyp 3 (AAV3) als die effizienteste Vektor für die Ausrichtung der menschlichen Leber Krebszellen.
Abstract
Rekombinante Vektoren auf einer nicht-pathogenen menschlichen Parvovirus basieren, haben die Adeno-assoziierten Virus 2 (AAV2) entwickelt worden und sind derzeit im Einsatz in einer Reihe von Gentherapie klinische Studien. In jüngerer Zeit haben eine Reihe von zusätzlichen AAV-Serotypen auch isoliert worden, von denen gezeigt wurde, um eine selektive Gewebe-Tropismus in verschiedenen kleinen und großen Tiermodellen 1 aufweisen. Von den 10 am häufigsten verwendete AAV-Serotypen ist AAV3 mit Abstand die am wenigsten effiziente Transduktion in Zellen und Geweben in vitro als auch in vivo.
Doch in unserem kürzlich veröffentlichten Studien, haben wir dokumentiert, dass AAV3 Vektoren menschlichen Leberkrebs transduzieren – hepatoblastoma (HB) und des hepatozellulären Karzinoms (HCC) – Zelllinien äußerst effizient, weil AAV3 nutzt menschlichen Hepatozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor als zellulären Co-Rezeptor für die Bindung und die Eintragung in diese Zellen 2,3.
In diesem Artikel beschreiben wir die notwendigen Schritte zur hocheffizienten Transduktion von humanen Leber-Krebszellen durch rekombinante AAV3 Vektoren, die ein Reporter-Gen zu erreichen. Die Verwendung von rekombinanten AAV3 Vektoren, die ein therapeutisches Gen kann schließlich das Potenzial der Gentherapie von Lebertumoren beim Menschen führen.
Protocol
Discussion
Rekombinante Vektoren auf einer nicht-pathogenen menschlichen Parvovirus, das Adeno-assoziierte Virus (AAV) wurden entwickelt und werden derzeit in einer Reihe von Gentherapie klinische Studien 5. Zuvor, von den 10 am häufigsten verwendete AAV-Serotypen, die Transduktionseffizienz von AAV3 Vektoren im Allgemeinen berichtet worden, um besonders niedrig sein, sowohl in vitro und in vivo 1. Aber unsere jüngsten Beobachtung, dass AAV3 Vektoren transduzieren menschlichen Leber Krebszelllinien außerordentlich gut, wie quantitativ mittels Durchflusszytometrie 2 bestimmt, und dass AAV3 nutzt die menschlichen Hepatozyten-Wachstumsfaktor-Rezeptor (hHGFR) als zelluläre Co-Rezeptor für die Bindung und die Eintragung in diese Zellen 3, empfehlen dringend eine selektive Gewebe-Tropismus AAV3 für den menschlichen Leberzellen im allgemeinen und der menschlichen Leber Krebszellen im Besonderen. Da jedoch AAV3 Vektoren auch transduzieren normalen menschlichen Hepatozyten effizient 2, würden ihre mögliche Verwendung in der Krebstherapie Anwendung in vivo werden negativ beeinflusst. Eine mögliche Strategie, um dieses mögliche Problem zu umgehen, besteht Transkriptions-Targeting von Krebszellen durch die Identifizierung eines Gens Produkt, das selektiv durch den Tumor produziert wird, aber nicht durch normale Hepatozyten. Zum Beispiel haben frühere Studien gezeigt, dass der Serumspiegel von α-Fetoprotein (AFP) als ein spezifischer Marker für die Verfolgung der Gegenwart, Progression und / oder Wiederauftreten bestimmter Arten von Leberkrebs eingesetzt werden, da normale Hepatozyten in der Regel sehr geringe Mengen produzieren dieses Proteins. In der Tat haben wir AAV3 Vektoren, die die AFP-Promotor Transgenexpression in Leberkrebszellen Ziel verwendet, aber nicht in normalen Hepatozyten 2 und Studien werden derzeit durchgeführt, um die Wirksamkeit dieses Ansatzes in einem murinen Xenograft-Modell von Leberkrebs zu testen. In unseren zusätzlichen Untersuchungen haben wir festgestellt, dass die Transduktion Effizienz verschiedener AAV-Serotyp Vektoren deutlich durch ortsspezifische Mutagenese von Oberflächen-exponierten Tyrosinreste in der viralen Kapside 6-14 erweitert werden. Seit 6 von 7 Oberflächen-exponierten Tyrosine auch in AAV3 konserviert sind, haben wir Mutagenese dieser Reste durchgeführt und festgestellt, dass die Transduktion von Tyrosin-Mutante AAV3 Vektoren deutlich wird in der menschlichen Leber Krebszellen (unveröffentlichte Daten) erweitert. Die Studien werden derzeit auch im Gange, um die Sicherheit und Wirksamkeit des Tyrosin-Mutante AAV3 Vektoren in Maus-Xenograft-Modellen für den menschlichen hepatoblastoma und des hepatozellulären Karzinoms zu bewerten und, sofern erfolgreich, die optimale Tyrosin-Mutante AAV3 Serotyp Vektoren können sich als nützlich erweisen für die Ausrichtung der menschlichen Leber Krebserkrankungen für die potenzielle Gentherapie.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Drs. R. Jude Samulski und Xiao Xiao für ihre Sachspenden von rekombinanten AAV3 und AAV-EGFP-Plasmiden, bzw., und Dr. Gail Tomlinson für die großzügige Bereitstellung von Hep293TT Zellen. Diese Arbeit wurde teilweise durch Public Health Service gewähren Zuschüsse R01 HL-076901, R01 HL-097088 und P01 DK-058327 (Projekt 1) von den National Institutes of Health (AS) unterstützt.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro | 10-0170CM | ||
| PEI | Polysciences | 23966 | ||
| Benzonase | Novagen | 70664-3 | ||
| HiTrap Q HP column | GE Healthcare | 17-1154-01 | ||
| Salmon sperm DNA | Fisher | NC9753983 | ||
| Iodixanol gradient | OptiPrep | 1114542 | ||
| G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |
References
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