Dans cet article, nous décrivons l'identification du virus adéno-associé de sérotype 3 (AAV3) comme le vecteur le plus efficace pour cibler les cellules humaines de cancer du foie.
Des vecteurs recombinants basés sur un parvovirus non-pathogènes humains, le virus adéno-associé 2 (AAV2) ont été développés et sont actuellement en usage dans un certain nombre d'essais cliniques de thérapie génique. Plus récemment, un certain nombre de sérotypes AAV supplémentaires ont également été isolées, qui ont été montrés à l'exposition sélective des tissus tropisme dans divers modèles animaux petits et grands 1. Parmi les 10 sérotypes les plus couramment utilisés AAV, AAV3 est de loin la moins efficace dans la transduction de cellules et de tissus in vitro ainsi que in vivo.
Cependant, dans nos études publiées récemment, nous avons documenté que AAV3 vecteurs transduire un cancer du foie humain – hépatoblastome (HB) et le carcinome hépatocellulaire (CHC) – lignées cellulaires de manière extrêmement efficace, car AAV3 utilise des récepteurs humains facteur de croissance des hépatocytes comme un co-récepteur cellulaire pour la liaison et l'entrée dans ces cellules 2,3.
Dans cet article, nous décrivons les étapes nécessaires pour atteindre de haute efficacité de transduction des cellules humaines de cancer du foie par recombinaison AAV3 vecteurs portant un gène rapporteur. L'utilisation de recombinants AAV3 vecteurs portant un gène thérapeutique peut éventuellement conduire à la thérapie génique potentiel de cancers du foie chez les humains.
Des vecteurs recombinants basés sur un parvovirus non pathogène pour l'homme, le virus adéno-associé (AAV) ont été développés et sont actuellement en usage dans un certain nombre d'essais cliniques de thérapie génique 5. Auparavant, les 10 sérotypes les plus couramment utilisés AAV, l'efficacité de la transduction des vecteurs AAV3 en général a été signalé comme étant particulièrement faible, tant in vitro et in vivo 1. Cependant, notre observation récente que AAV3 vecteurs transduire des lignées cellulaires de cancer du foie, excessivement bien, tel que déterminé quantitativement par deux cytométrie en flux, et que AAV3 utilise le récepteur hépatocytaire humaine du facteur de croissance (hHGFR) comme un co-récepteur cellulaire d'entrée obligatoire et dans ces cellules 3, suggèrent fortement une approche sélective des tissus tropisme du AAV3 des cellules hépatiques humaines en général, et des cellules humaines de cancer du foie en particulier. Toutefois, depuis AAV3 vecteurs aussi transduire efficacement les hépatocytes humains normaux 2, leur utilisation potentielle dans le traitement du cancer de demande de gène in vivo seraient affectées négativement. Une stratégie possible pour contourner ce problème potentiel transcriptionnel implique le ciblage des cellules cancéreuses en identifiant un produit génique qui est sélectivement produites par la tumeur, mais pas par les hépatocytes normaux. Par exemple, des études antérieures ont montré que les concentrations sériques de α-foetoprotéine (AFP) sont utilisés comme un marqueur spécifique pour le suivi de la présence, la progression et / ou à la réapparition de certains types de cancers du foie, puisque les hépatocytes normaux produisent généralement de très petites quantités cette protéine. En effet, nous avons utilisé AAV3 vecteurs contenant le promoteur AFP pour cibler l'expression du transgène dans les cellules de cancer du foie, mais pas dans les hépatocytes normaux 2, et des études sont actuellement en cours pour tester l'efficacité de cette approche dans un modèle murin de xénogreffe de cancer du foie. Dans nos études supplémentaires, nous avons observé que l'efficacité de transduction des différents vecteurs AAV de sérotype peut être considérablement augmentée par mutagenèse dirigée de la surface exposée résidus tyrosines dans les capsides virales 6-14. Depuis 6 sur 7 exposées à la surface tyrosines sont également conservées dans AAV3, nous avons effectué une mutagenèse dirigée de ces résidus ainsi observé que l'efficacité de transduction de la tyrosine-mutant AAV3 vecteurs est significativement accrue dans les cellules humaines de cancer du foie (données non publiées). Des études sont également en cours pour évaluer l'innocuité et l'efficacité de la tyrosine-AAV3 mutant vecteurs dans des modèles de xénogreffe de souris pour hépatoblastome humain et le carcinome hépatocellulaire, et en cas de succès, la tyrosine-optimale mutant vecteurs sérotype AAV3 peuvent se révéler utiles pour le ciblage du foie humain cancers de la thérapie génique potentielle.
The authors have nothing to disclose.
Nous remercions les Drs. R. Jude Samulski et Xiao Xiao pour leurs dons en nature de recombinaison AAV3 et AAV-EGFP plasmides, respectivement, et le Dr Gail Tomlinson pour avoir généreusement fourni les cellules Hep293TT. Cette recherche a été financée en partie par Service de santé publique accorde bourse R01 HL-076901, R01 HL-097088, et P01 DK-058327 (Projet 1) de la National Institutes of Health (AS).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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DMEM | Cellgro | 10-0170CM | ||
PEI | Polysciences | 23966 | ||
Benzonase | Novagen | 70664-3 | ||
HiTrap Q HP column | GE Healthcare | 17-1154-01 | ||
Salmon sperm DNA | Fisher | NC9753983 | ||
Iodixanol gradient | OptiPrep | 1114542 | ||
G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |