Haute-efficacité de la transduction des cellules cancéreuses du foie par recombinants sérotype virus adéno-associé 3 Vecteurs

1. Emballage de virus recombinants adéno-associé de sérotype 3 (rAAV3) Vecteurs Allez sur le site: " http://www.geguchadze.com/calc "et de calculer la quantité d'ADN. Pré-mélange plasmides pHelper (aide adénovirus), pACG2c3 (AAV helper) et pdsAAV-CB-EGFP (rAAV vecteur) dans un milieu sans SVF et des antibiotiques. Le volume total devrait être 8750 uL de dix à 15 cm 2 plaques. Ajouter directement 1250 uL de PEI (0,1% m / v, Polysciences, Cat # 23966, pH 4,5) dans la solution d'ADN à l'étape 1.2. Vortex la solution d'ADN-Prince-Édouard pendant quelques secondes. Incuber l'ADN-Prince-Édouard solution pour former un complexe de 5 min à température ambiante (RT). Ajouter 1 mL de l'ADN-Prince-Édouard solution par 15 cm 2 plaques. Retirer moyenne après 4 heures, en remplaçant avec des produits frais 25 ml de milieu complet 10% de FBS (C-DMEM). Soixante-douze heures après transfection, les cellules gratter et verser dans un tube de 250 ml à centrifuger conique. Centrifuger à 3000 rpm à 4 ° C pendant 10 min. Verser le liquide surnageant. Re-suspendre le culot cellulaire dans 5 ml de RB TMS tampon (50 mM Tris-HCl, NaCl 150 mM, pH 8,0). Transfert à un nouveau 15 ml tube conique. Congeler dans la glace sèche-éthanol de bain pendant 10 minutes et le dégel à 37 ° C pendant 10 min. Répétez trois fois. Ajouter 1 ul de 4,8 M MgCl 2 et 2 pi de Benzonase (25 U / uL, Novagen, Cat # 70664-3). Vortex et laisser incuber à 37 ° C pendant 40 min. Isoler à 4000 rpm à 4 ° C pendant 40 minutes et recueillir le surnageant (lysat clarifié). Dans un tube de 13 ml à centrifuger Quick-Seal (Beckman, Cat # 342413), la charge iodixanol gradient (OptiPrep, Cat # 1114542) de haut en bas: 2 mL de 15%, 2 ml de 25%, 1,5 mL de 40% et 1,5 ml de iodixanol 60%. Chargez le surnageant (étape 1.12) sur le haut de la pente iodixanol. Remplir les tubes avec RB TMS Tampon. Centrifuger à 75000 rpm pendant 1 heure à 16 ° C en utilisant Beckman 90TI rotor. Recueillir la fraction iodixanol 40% en insérant une seringue à la limite de 40-60%. Transfert de la fraction iodixanol 40% en un tube conique 50 ml et porter à 40 ml avec le tampon A. (Tris 20 mM, NaCl 15 mM, pH 8,5) Assembler l'appareil de filtration à l'aide HiTrap Q HP colonne (GE Healthcare, Cat # 17-1154-01). Laver la colonne avec le tampon suivant: 25 ml de tampon A (Tris 20 mM, NaCl 15 mM, pH 8,5);; 25 ml de tampon B (Tris 10 mM, NaCl 500 mM, pH 8,5), 50 ml de tampon A 40 ml d'échantillon de virus dans le tampon A, 50 ml de tampon A (Tris 20 mM, NaCl 15 mM, pH 8,5);; 20 ml de tampon C (20 mM Tris, 175 mM NaCl, pH 8,5) Recueillir C dans un tampon concentrateurs 20 mL d'Apollo (Orbital Biosciences). Centrifuger à 3000 rpm à 4 ° C pendant 10 min. Jeter l'effluent à travers et ajouter 20 ml de PBS et centrifuger refroidi à 3.000 tpm, à 4 ° C pendant 10 min. Jeter l'effluent à travers et ajouter 500 ul de PBS refroidi. Lavez les vecteurs hors de la membrane et le transfert d'traité à la silicone et de stocker des tubes Eppendorf congelés dans de petites aliquotes à -80 ° C. 2. Détermination de rAAV3 Les titres Vecteur Dégeler 10 uL de virus purifié dans un tube Eppendorf sur la glace. Ajouter 40 uL de DDH 2 O. Ajouter 0,2 ul de Benzonase (25 U / uL, Novagen, Cat # 70664) et incuber à 37 ° C pendant 1 heure. Prenez 50 uL de standard plasmidique (0,2 ng / uL) dans un autre tube Eppendorf. Ajouter 50 ul de 100 mM NaOH dans chaque tube et incuber à 65 ° C pendant 30 min. Réfrigérer la glace immédiatement pendant au moins 5 min. Couper la membrane de transfert (Millipore, Cat # INYC00010) selon Bio-Dot Papier filtre (Bio-Rad, Cat # 1620161). Rincer la membrane en 10x SSC avec trois papiers filtres pendant 20 min. Set slot blot SF Appareillage (Bio-Dot, Cat # 170-6542). Connectez-vous à une fiole à vide et ajouter 100 ul de 10x SSC aux appareils slot blot. Ajouter 100 ul de 20x SSC et 1 pl de colorant de chargement 6x à chacun des échantillons à l'étape 2.5. Charge 100 ul de chaque échantillon sur la membrane de l'appareil slot blot. Ajouter un autre uL 100 de 10x SSC dans chacun des échantillons. Répétez les étapes 2.9 et 2.10 jusqu'à ce que tous les échantillons va à travers la membrane. Démonter l'appareil et le slot blot retirer la membrane. Mettez-le en Linker inspecteur SL-1000 Crosslinker UV. Tourner sur "l'énergie", "Optimal Crosslink" (spectacle 1200) et pousser "Démarrer". Faire bouillir 1 ml de sperme de saumon (SS) ADN (Fisher, Cat # NC9753983) pendant 5 min. Réfrigérer la glace pendant au moins 5 min. Préparer la solution de pré-hybridation en mélangeant 27,5 ml de DDH 2 O, 15 ml de SSC 20x, 5 ml de solution 50x Denhardt, 1,25 mL de SDS 20%, 0,25 mL de Polya et 1 ml de SS ADN de l'étape 2.13. Suspendre la membrane dans 25 ml de solution de pré-hybridation dans un cylindre de verre bouché et incuber à 65 ° C dans une chambre d'hybridation pendant la nuit. Diluer 50 modèles ng d'ADN dans 10 ul de DDH 2 O. Faire bouillir à 100 ° C pendant 5 min et laisser refroidir sur la glace immédiatement pendant au moins 5 min. Centrifuger à 3000 rpm à température ambiante pendant 1 min. Ajouter 2 ul de 10 mM dNTP 3 (manque dCTP), 2 pl de Mix hexanucléotide (Roche, Cat # 11277081001), 1 pl de Klenow (Roche, Cat # 11008404001) et 5 pi de α -32 P-dCTP. Incuber à 37 ° C pendant 10 min. Centrifugeuse G-50 colonnes (GE Healthcare, Cat # 27-5330-01) à 3000 rpm pendant 2 min. la charge de la sonde à l'étape 2.17 dans la colonne. Centrifuger à 3000 rpm pendant 2 min et recueillir les actions accréditives. Comptez radioactivité. Faire bouillir la sonde à 100 ° C pendant 5 min et laisser refroidir sur la glace immédiatement pendant au moins 5 min. Ajouter la sonde (6×10 5 cpm / ml) dans la solution de pré-hybridation avec la membrane. Incuber une nuit à 65 ° C dans une chambre d'hybridation. Jeter la solution d'hybridation et rincer la membrane dans 2x SSC 0,1% SDS à température ambiante pendant 15 min. Jeter la solution et rincer la membrane de 0,1 x SSC + 0,1% SDS à 65 ° C pendant 30 min. Jeter la solution et rincer la membrane de 0,1 x SSC à brève RT. Exposer le film à -80 ° C pendant 6 heures et de développer le film. Un résultat typique est montré dans la figure 1. 3. rAAV3 Vecteur médiée Transduction et l'expression du transgène dans les cellules humaines de cancer du foie Graine 1×10 4 cellules (soit Huh7 ou Hep293TT) dans chaque puits de plaque de 96 puits. Incuber dans un incubateur humidifié CO 2 pendant au moins 18 heures. Retirer de la plaque de support de 96 puits. Laver les cellules deux fois avec 50 ul de milieu sans SVF et des antibiotiques et à enlever. Ajouter 50 uL de milieu sans SVF et des antibiotiques et des vecteurs rAAV à 5000 vgs / cellule. Incuber les plaques dans l'incubateur CO 2 pendant 4 heures. Jeter la moyenne. Laver les cellules deux fois avec 50 ul de milieu complet et à enlever. Ajouter 150 pi de DMEM-C dans chaque puits et incuber la plaque dans incubateur à CO 2 pendant 72 heures, et de visualiser l'expression de l'EGFP en utilisant un microscope à fluorescence (DMI 4000B; Leica Microsystems). Images à partir de trois puits de cellules infectées sont analysées quantitativement par ImageJ logiciels d'analyse (NIH, Bethesda, MD, USA). L'expression du transgène est évalué comme surface totale de fluorescence verte (2 pixels) par le champ visuel. Un résultat typique est montré dans la figure 2. L'expression du transgène peut également être déterminée par cytométrie en flux. 4. Les résultats représentatifs: En suivant le protocole décrit ci-dessus, on peut générer des vecteurs AAV de sérotype efficacement. Le rendement typique est d'environ 500 uL contenant ~ 10 11 vgs / uL d'purifiée stock de vecteur. La pureté du stock de vecteur est déterminé en comparant les signaux d'hybridation sur taches quantitatives emplacement de l'ADN, avec et sans la digestion Benzonase. Purifié rAAV3 vecteurs transduire un cancer du foie humain – hépatoblastome (HB) et le carcinome hépatocellulaire (CHC) – lignées cellulaires de façon efficace. Figure 1. Quantitative ADN slot-blot pour déterminer les titres des rAAV3 vecteurs. Deux dilutions des stocks viraux purifiés, digérés avec Benzonase (rangée du haut) ont été analysés sur quantitatives taches slot d'ADN avec 32 P-étiquetés sonde d'ADN spécifique EGFP. Le titre du AAV3 vecteur a été déterminée par comparaison avec 1 ng (rangée du milieu) ou 10 ng (rangée du bas) de l'AAV-EGFP normes plasmide chargé sur la membrane. Les numéros correspondent aux copies d'ADN. Figure 2. Vecteur AAV recombinant médiée par l'expression du transgène dans les cellules humaines de cancer du foie. Cellules Hep293TT, une création récente lignée humaine de cellules d'hépatoblastome 4, ont été soit (à gauche) maquette infectés, ou transduites avec 5000 vgs / cellule soit scAAV2-EGFP ou scAAV3-EGFP vecteurs à 37 ° C pendant 2 heures. L'expression du transgène a été visualisée 72 heures après la transduction utilisant un microscope à fluorescence.