عالية الكفاءة تنبيغ الخلايا السرطانية الكبد المصلي المؤتلف الفيروسات الغدة المرتبطين 3 ناقلات
Summary
في هذه المقالة ، ونحن تصف تحديد النمط المصلي الفيروس الغدة المرتبطة 3 (AAV3) مثل ناقلات الأكثر كفاءة لاستهداف خلايا سرطان الكبد.
Abstract
نواقل المؤتلف على أساس البارفو غير الممرضة للإنسان ، وقد تم تطوير هذا الفيروس الغدة المرتبطة 2 (AAV2) ، والمستخدمة حاليا في عدد من التجارب السريرية العلاج الجيني. في الآونة الأخيرة ، وعدد من المصليين AAV إضافية كما تم المعزولة ، والتي ثبت لعرض انتقائي الأنسجة tropism في مختلف النماذج الحيوانية الكبيرة والصغيرة 1. من الأنماط المصلية 10 AAV الأكثر شيوعا ، AAV3 هي حتى الآن في الأقل كفاءة transducing الخلايا والأنسجة في المختبر وكذلك في الجسم الحي.
ومع ذلك ، في دراساتنا المنشورة مؤخرا ، وقد وثقت لنا أن AAV3 ناقلات تنبيغ الإنسان بسرطان الكبد — ورم أرومي كبدي (HB) وسرطان الخلايا الكبدية (HCC) — خطوط الخلايا بكفاءة للغاية بسبب AAV3 يستخدم الإنسان مستقبلات عامل النمو الكبدية الخلوية كما شارك في لمستقبلات ملزمة والدخول في هذه الخلايا 2،3.
في هذه المقالة ، نحن تصف الخطوات اللازمة لتحقيق الكفاءة العالية تنبيغ من خلايا سرطان الكبد عن طريق ناقلات المؤتلف AAV3 يحمل الجين المراسل. قد تستخدم ناقلات AAV3 المؤتلف يحمل الجين العلاجي تؤدي في نهاية المطاف إلى العلاج الجيني المحتملة لسرطان الكبد لدى البشر.
Protocol
Discussion
وقد وضعت ناقلات المؤتلف على أساس البارفو غير ممرضة الإنسان ، والفيروس الغدة المرتبطة بها (AAV) ، والمستخدمة حاليا في عدد من التجارب السريرية العلاج الجيني 5. سابقا ، من الأنماط المصلية 10 AAV الأكثر شيوعا ، وقد تم الإبلاغ عن كفاءة تنبيغ من AAV3 ناقلات بصفة عامة لتكون منخفضة بشكل خاص ، سواء في المختبر والمجراة 1. ومع ذلك ، لدينا الملاحظة الأخيرة التي AAV3 ناقلات تنبيغ سرطان الكبد خطوط الخلايا البشرية بشكل جيد للغاية ، كما يحدد الكمية التي التدفق الخلوي 2 ، والتي تستخدم AAV3 النمو الكبدية البشرية مستقبلات عامل (hHGFR) كما شارك في مستقبلات الخلوية للدخول في هذه الملزمة و 3 خلايا ، توحي بقوة انتقائي الأنسجة tropism من AAV3 لخلايا الكبد البشرية بصفة عامة ، وخلايا سرطان الكبد بشكل خاص. ومع ذلك ، منذ AAV3 ناقلات تنبيغ أيضا خلايا الكبد البشرية العادية 2 بكفاءة ، واحتمال استخدامها في علاج الجينات السرطانية في الجسم الحي تطبيق ستتأثر سلبا. استراتيجية واحدة ممكنة للتحايل على هذه المشكلة المحتملة تشمل الترانسكربتي استهداف الخلايا السرطانية من خلال تحديد الجين المنتج الذي يتم انتاجه بشكل انتقائي من الورم ، ولكن ليس عن طريق خلايا الكبد الطبيعية. على سبيل المثال ، أظهرت الدراسات السابقة التي تستخدم مستويات مصل α – بروتين جنيني (اف ب) كعلامة محددة لتتبع وجود ، التقدم ، و / أو تكرار بعض أنواع سرطانات الكبد ، وخلايا الكبد الطبيعية منذ تنتج عادة كميات صغيرة جدا من هذا البروتين. في الواقع ، لقد استخدمنا AAV3 ناقلات تحتوي على مروج لوكالة فرانس برس في استهداف التعبير التحوير في خلايا سرطان الكبد ، ولكن ليس في خلايا الكبد الطبيعية 2 ، وتجري حاليا دراسات لاختبار فعالية هذا النهج في نموذج الفئران طعم أجنبي من سرطان الكبد. في دراساتنا إضافية ، لاحظنا أنه يمكن كفاءة تنبيغ مختلف ناقلات AAV المصلي زيادة ملموسة بنسبة الطفرات الموقع موجهة للمياه السطحية المعرضة للمخلفات في التيروزين الفيروسية capsids 14/06. حيث يتم حفظها أيضا 6 من 7 السطحية المعرضة للtyrosines في AAV3 ، وقد أجرينا موقع الطفرات الموجهة من هذه المخلفات وأشار إلى أن يتم تحسين كبير في كفاءة تنبيغ ناقلات AAV3 التيروزين ، متحولة في خلايا سرطان الكبد (بيانات غير منشورة). كما أن الدراسات التي تجري حاليا لتقييم سلامة وفعالية النواقل AAV3 التيروزين ، متحولة في نماذج طعم أجنبي الماوس لورم أرومي كبدي الإنسان وسرطان الكبد ، وإذا نجحت ، فإن الأمثل المصلي AAV3 التيروزين ، متحولة نواقل قد تكون مفيدة لاستهداف الكبد الإنسان السرطان العلاج الجيني لالمحتملين.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر الدكاترة. ر وجود Samulski شياو شياو للهدايا من نوعها AAV3 المؤتلف والبلازميدات AAV – EGFP ، على التوالي ، والدكتور توملينسون غيل بسخاء لتوفير خلايا Hep293TT. وأيد هذا البحث في جزء من دائرة الصحة العامة R01 المنح منحة HL – 076901 ، 097088 HL – R01 ، وP01 DK – 058327 (المشروع 1) من المعاهد الوطنية للصحة (ك).
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro | 10-0170CM | ||
| PEI | Polysciences | 23966 | ||
| Benzonase | Novagen | 70664-3 | ||
| HiTrap Q HP column | GE Healthcare | 17-1154-01 | ||
| Salmon sperm DNA | Fisher | NC9753983 | ||
| Iodixanol gradient | OptiPrep | 1114542 | ||
| G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |
References
- Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. Analysis of AAV serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection. Mol Ther. 16, 1073-1080 (2008).
- Glushakova, L. G., Lisankie, M. J., Eruslanov, E. B., Ojano-Dirain, C., Zolotukhin, I., Liu, C., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. AAV3-mediated transfer and expression of the pyruvate dehydrogenase E1 alpha subunit gene causes metabolic remodeling and apoptosis of human liver cancer cells. Mol Genet & Metabol. 98, 289-299 (2009).
- Ling, C., Lu, Y., Kalsi, J. K., Jayandharan, G. R., Li, B., Ma, W., Cheng, B., Gee, S. W., McGoogan, K. E., Govindasamy, L., Zhong, L., Agbandje-McKenna, M., Srivastava, A. Human hepatocyte growth factor receptor is a cellular coreceptor for adeno-associated virus serotype 3. Hum Gene Ther. 21, 1741-1747 (2010).
- Chen, T. T., Rakheja, D., Hung, J. Y., Hornsby, P. J., Tabaczewski, P., Malogolowkin, M., Feusner, J., Miskevich, F., Schultz, R., Tomlinson, G. E. Establishment and characterization of a cancer cell line derived from an aggressive childhood liver tumor. Pediatr Blood & Cancer. 53, 1040-1047 (2009).
- Daya, S., Berns, K. I. Gene therapy using adeno-associated virus vectors. Clin Microbiol Rev. 21, 583-593 (2008).
- Zhong, L., Li, B., Mah, C. S., Govindasamy, L., Agbandje-McKenna, M., Cooper, M., Herzog, R. W., Zolotukhin, I., Warrington, K. H., Weigel-Van Aken, K. A., Hobbs, J. A., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A. Next generation of adeno-associated virus 2 vectors: point mutations in tyrosines lead to high-efficiency transduction at lower doses. Proc Natl Acad Sci USA. 105, 7827-7832 (2008).
- Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Min, S. H., Chiodo, V., Pang, J. J., Zhong, L., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Lewin, A. S., Hauswirth, W. W. High-efficiency transduction of the mouse retina by tyrosine-mutant AAV serotype vectors. Mol Ther. 17, 463-471 (2009).
- Jayandharan, G. R., Zhong, L., Sack, B. K., Rivers, A. E., Li, M., Li, B., Herzog, R. W., Srivastava, A. Optimized adeno-associated virus (AAV)-protein phosphatase-5 helper viruses for efficient liver transduction by single-stranded AAV vectors: therapeutic expression of factor IX at reduced vector doses. Hum. Gene Ther. 21, 271-283 (2010).
- Li, M., Jayandharan, G. R., Li, B., Ling, C., Ma, W., Srivastava, A., Zhong, L. High-efficiency transduction of fibroblasts and mesenchymal stem cells by tyrosine-mutant AAV2 vectors for their potential use in cellular therapy. Hum Gene Ther. 21, 1527-1543 (2010).
- Kauss, M. A., Smith, L. J., Zhong, L., Srivastava, A., Wong, K. K. J. r., Chatterjee, S. Enhanced long-term transduction and multilineage engraftment of human hematopoietic stem cells transduced with tyrosine-modified recombinant adeno-associated virus serotype 2. Hum Gene Ther. 21, 1129-1136 (2010).
- Qiao, C., Zhang, W., Yuan, Z., Shin, J. H., Li, J., Jayandharan, G. R., Zhong, L., Srivastava, A., Xiao, X., Duan, D. Adeno-associated virus serotype 6 capsid tyrosine-to-phenylalanine mutations improve gene transfer to skeletal muscle. Hum Gene Ther. 21, 1343-1348 (2010).
- Markusic, D. M., Herzog, R. W., Aslanidi, G. V., Hoffman, B. E., Li, B., Li, M., Jayandharan, G. R., Ling, C., Zolotukhin, I., Ma, W., Zolotukhin, S., Srivastava, A., Zhong, L. High-efficiency transduction and correction of murine hemophilia B using AAV2 vectors devoid of multiple surface-exposed tyrosines. Mol Ther. 18, 2048-2056 (2010).
- Ojano-Dirain, C., Glushakova, L. G., Zhong, L., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Srivastava, A., Stacpoole, P. W. An animal model of PDH deficiency using AAV8-siRNA vector-mediated knockdown of pyruvate dehydrogenase E1α. Mol Genet & Metabol. 101, 183-191 (2010).
- Petrs-Silva, H., Dinculescu, A., Li, Q., Deng, W. T., Pang, J. J., Min, S. H., Chiodo, V., Neeley, A. W., Govindasamy, L., Bennett, A., Agbandje-McKenna, M. Novel properties of tyrosine-mutant AAV2 vectors in the mouse retina. Mol Ther. , (2011).
