In questo articolo, si descrive l'identificazione del sierotipo del virus adeno-associati 3 (AAV3) come il vettore più efficace per le cellule umane di cancro del fegato.
Vettori ricombinanti sulla base di una non patogeno parvovirus umano, il virus adeno-associati 2 (AAV2) sono stati sviluppati e sono attualmente in uso in un certo numero di studi clinici di terapia genica. Più recentemente, una serie di ulteriori sierotipi AAV sono stati anche isolati, che hanno dimostrato di esporre selettivo-trofismo dei tessuti in vari modelli animali piccoli e grandi 1. Dei 10 sierotipi più comunemente utilizzati AAV, AAV3 è di gran lunga il meno efficiente in trasduzione cellule e tessuti in vitro e in vivo.
Tuttavia, nei nostri studi di recente pubblicazione, abbiamo documentato che AAV3 vettori trasdurre il cancro del fegato umano – epatoblastoma (HB) e di carcinoma epatocellulare (HCC) – linee di cellule estremamente efficiente perché utilizza AAV3 umano recettore del fattore di crescita degli epatociti come un cellulare co-recettore per il legame e l'ingresso in queste cellule 2,3.
In questo articolo, si descrivono i passaggi necessari per ottenere alta efficienza di trasduzione di cellule umane di cancro del fegato da ricombinante AAV3 vettori che trasportano un gene reporter. L'uso di vettori ricombinanti AAV3 portatrice di un gene terapeutico può portare alla terapia genica potenziale dei tumori del fegato negli esseri umani.
Vettori ricombinanti sulla base di una non patogeno parvovirus umano, il virus adeno-associato (AAV) sono stati sviluppati e sono attualmente in uso in un certo numero di studi clinici di terapia genica 5. In precedenza, dei 10 sierotipi più comunemente utilizzati AAV, l'efficienza di trasduzione del AAV3 vettori in genere è stato segnalato per essere particolarmente bassi, sia in vitro che in vivo 1. Tuttavia, la nostra recente osservazione che AAV3 vettori trasdurre fegato umano linee cellulari tumorali estremamente bene, come determinato quantitativamente mediante citometria di flusso 2 e che AAV3 utilizza il recettore umano di crescita degli epatociti (fattore hHGFR) come un cellulare co-recettore per l'iscrizione vincolante e in questi cellule 3, suggeriscono fortemente una selettiva dei tessuti di AAV3 tropismo per le cellule di fegato umano in generale, e cellule umane di cancro del fegato in particolare. Tuttavia, poiché AAV3 vettori anche trasdurre normali epatociti umani in modo efficiente 2, il loro potenziale utilizzo in applicazione della terapia genica del cancro in vivo sarebbe negativamente. Una possibile strategia per aggirare questo potenziale problema coinvolge trascrizionale-targeting delle cellule tumorali attraverso l'identificazione di un prodotto gene che è selettivamente prodotta dal tumore, ma non dagli epatociti normali. Per esempio, studi precedenti hanno dimostrato che i livelli sierici di α-fetoproteina (AFP) è utilizzato come marcatore specifico per il monitoraggio della presenza, la progressione, e / o la recrudescenza di alcuni tipi di tumori del fegato, dato che epatociti normali generalmente producono piccole quantità di questa proteina. Infatti, abbiamo utilizzato AAV3 vettori contenenti il promotore AFP per indirizzare l'espressione del transgene nelle cellule di cancro al fegato, ma non negli epatociti normali 2, e gli studi sono attualmente in corso per testare l'efficacia di questo approccio in un modello murino xenotrapianto di cancro al fegato. Nei nostri studi ulteriori, abbiamo osservato che l'efficienza di trasduzione di vari vettori AAV sierotipo può essere significativamente aumentata da mutagenesi sito-diretta di superficie esposti residui di tirosina nel capsidi virale 6-14. Dal 6 di 7 superficie esposta tirosine sono inoltre conservati in AAV3, abbiamo svolto mutagenesi sito-diretta di detti residui e osservato che l'efficienza di trasduzione di tirosin-mutante AAV3 vettori è significativamente migliorata nelle cellule umane di cancro del fegato (dati non pubblicati). Gli studi sono attualmente in corso per valutare la sicurezza el'efficacia della tirosin-mutante AAV3 vettori nei modelli di xenotrapianto mouse per epatoblastoma umano e il carcinoma epatocellulare, e in caso di successo, l'ottimale tirosina-mutante vettori sierotipo AAV3 potrebbe rivelarsi utile per indirizzare fegato umano tumori per la terapia genica potenziale.
The authors have nothing to disclose.
Ringraziamo Drs. R. Jude Samulski e Xiao Xiao per i loro doni tipo di ricombinante AAV3 e AAV-EGFP plasmidi, rispettivamente, e il dottor Tomlinson Gail generosamente per fornire cellule Hep293TT. Questa ricerca è stata sostenuta in parte dal Public Health Service concedere borse di R01 HL-076901, R01 HL-097088, e DK P01-058327 (Progetto 1) dal National Institutes of Health (AS).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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DMEM | Cellgro | 10-0170CM | ||
PEI | Polysciences | 23966 | ||
Benzonase | Novagen | 70664-3 | ||
HiTrap Q HP column | GE Healthcare | 17-1154-01 | ||
Salmon sperm DNA | Fisher | NC9753983 | ||
Iodixanol gradient | OptiPrep | 1114542 | ||
G-50 Columns | GE Healthcare | 27-5330-01 |