La disección de los elementos humanos Cuerpo Vítreo para el análisis proteómico

1. La disección del segmento anterior. La córnea se elimina en primer lugar hacer una incisión en el limbo en la cámara anterior con una hoja de 15 ° (Figura 1). A continuación, una hoja de curva escleral córnea-tijera se introduce en la cámara anterior. Cortes circunferenciales se hacen en la córnea, justo por delante del limbo. 0,12 Colibri pinzas y tijeras Westcott se utilizan para cortar la circunferencia anterior del iris en el cuerpo ciliar. El núcleo del cristalino se extrae con pinzas de 0,12 Colibri o una cuchilla de 15 ° (supersharp) y la corteza y la cápsula con las pinzas. 2. La aspiración central del vítreo. Una aguja de calibre 23 en una jeringa de 5 cc se inserta en la mitad de vítreo (Figura 1). Aproximadamente 1 ml o más de núcleo vítreo es aspirada suavemente. La muestra se coloca en un tubo de microcentrífuga y luego en nitrógeno líquido. 3. La disección hialoidea anterior. La hialoides anterior se ve como un anillo semi-transparente, mediante el ajuste de la luz incidente de una luz de gallina microscopio cuello. Aspiración previa de la base del vítreo se separa la hialoides anterior de otras estructuras para facilitar su identificación. La hoja de tejido elástico se hala cuidadosamente lejos del cuerpo ciliar con Colibri o fórceps vestirse y cortarse con tijeras Vannas. Esta maniobra se repite. La muestra se coloca en un tubo de microcentrífuga y luego en nitrógeno líquido. 4. Disección base del vítreo. Utilizando unas pinzas 0,12 para estabilizar el ocular, tijeras Westcott se utilizan para "flor" a los ojos, haciendo cuatro equidistantes para aliviar el estrés cortes del cuerpo ciliar hacia la cabeza del nervio óptico. La pars plicata del cuerpo ciliar (Figura 2) se elimina de cada uno de los cuadrantes con tijeras de Westcott. La base del vítreo se amarra a ambos lados de la ora serrata con unas pinzas sobre la pars plana y la retina (Figura 2). La tracción continua sobre la base del vítreo se aplica con las pinzas. Corte con tijeras de Westcott secuencial extractos de un pañuelo de papel semi-transparente, con un "collar de perlas", aspecto que se extirpa. La muestra se coloca en un tubo de microcentrífuga y luego en nitrógeno líquido. 5. Eliminación de la corteza vítrea. La pars plana se extirpa de cada uno de los cuadrantes con tijeras de Westcott mediante la reducción de la hoja de aproximadamente 3 mm por detrás de la ora serrata (Figura 2). Entre los prospectos de tejidos, la corteza del vítreo se visualiza como una película semi transparente. La película elástica está bien agarrado con pinzas de 0,12 o en poder de la adhesión a una esponja Weck-Cel quirúrgica. La corteza del vítreo se tira a la retina y corta con tijeras Westcott (Figura 1). La muestra se coloca en un tubo de microcentrífuga y luego en nitrógeno líquido. Todas las muestras se almacenan a -80 ° C hasta el momento utilizados para la experimentación. 6. Resultados representante Las muestras de tejido puede ser procesado por una variedad de métodos para experimentos específicos. En nuestro caso, las muestras fueron enviadas para análisis de proteínas por SDS-PAGE (Figura 3). Figura 1. Corte transversal del ojo humano que representa subestructuras diferentes partes del cuerpo vítreo. El humor vítreo más anterior es una fina capa de colágeno llamada la hialoides anterior. El núcleo vítreo comprende toda la región central del cuerpo vítreo. Esta parte del vítreo es más acuosa, en contraste con la base del vítreo, que es viscoso, lo suficiente como para ser captado por los fórceps y se une firmemente con el cuerpo ciliar y la retina subyacente. Que abarca el núcleo vítreo es un shell de colágeno muy fino llamado la corteza del vítreo. Figura 2. Anatomía base del vítreo. La base del vítreo es una subestructura semi-transparente del cuerpo vítreo, situado a lo largo de la ora serrata (flechas blancas), que es la línea divisoria que separa el cuerpo ciliar y la retina. El borde anterior de la base del vítreo se extiende sobre la pars plana (línea blanca) del cuerpo ciliar. El borde posterior de la base del vítreo se extiende de 2 a 3 mm por detrás de la ora serrata (tablero blanco). Para extirpar la base del vítreo, fórceps se utilizan para agarrar el tejido y tire de ella fuera del cuerpo ciliar y la retina subyacente. Una vez elevada, tijeras Westcott se utilizan para cortar a lo largo de la base. Figura 3. Una dimensión SDS-PAGE de los elementos del cuerpo vítreo. Concentración de proteínas totales de la hialoides anterior, base del vítreo, vitnúcleo vítreo, y la corteza vítrea fueron 11.24, 20.1, 16.61, 14.24 mg / ml, respectivamente. Electroforesis en gel se realizó en 200 kV durante 45 minutos, se tiñeron con Flamingo (Bio-Rad), y se visualizan mediante un sistema de VersaDoc imágenes (Bio-Rad). Los perfiles de los diferentes tejidos muestran varias bandas similares, lo que indica de conservación o la contaminación cruzada de las proteínas, así como bandas únicas (asterisco), lo que indica proteínas diferencialmente localizados.