Dissection of Human Glaskörper Elemente für Proteomanalyse

1. Anterior Segment Dissection. Die Hornhaut wird zunächst durch einen Einschnitt am Limbus in die Vorderkammer mit einem 15 ° Klinge (Abbildung 1) entfernt. Dann eine Klinge von gekrümmten Hornhaut-Sklera-Schere ist in die Vorderkammer eingeführt. Umlaufende Schnitte in der Hornhaut gemacht, unmittelbar vor dem Limbus. 0,12 Colibri Pinzette und Schere Westcott werden verwendet, um die Iris umfänglich anterior des Ziliarkörpers geschnitten. Der Linsenkern wird mit 0,12 Colibri Zange oder einem 15 °-Klinge (superscharfen) und der Hirnrinde und Kapsel mit einer Pinzette entfernt. 2. Glaskörper-Core Aspiration. Ein 23-Gauge-Nadel auf einer 5-ml-Spritze ist in der Mitte eingesetzt Glaskörper (Abbildung 1). Etwa 1 ml oder mehr glasigen Kern ist vorsichtig abgesaugt. Die Probe wird dann in einem Mikrozentrifugenröhrchen und dann in flüssigem Stickstoff gelegt. 3. Anterior hyaloiden Dissection. Der vordere hyaloidea ist als semi-transparent Ring durch die Anpassung des einfallenden Lichts von einem Schwanenhals Mikroskop Licht gesehen. Vorherige Aspiration des Glaskörpers Kern trennt den vorderen hyaloiden von anderen Strukturen zur leichteren Identifizierung. Das Blatt aus elastischem Gewebe wird vorsichtig vom Ziliarkörper mit Colibri oder Kornzange gezogen und schneiden Sie mit Vannas Schere. Dieses Manöver wird wiederholt. Die Probe wird dann in einem Mikrozentrifugenröhrchen und dann in flüssigem Stickstoff gelegt. 4. Glaskörperbasis Dissection. Mit 0,12 Pinzette auf die Augenmuschel zu stabilisieren, werden Westcott Schere "Blume" das Auge, indem sie vier gleichmäßig verteilte Spannungsarmglühen Schnitte aus dem Ziliarkörper in Richtung des Sehnervenkopfes eingesetzt. Die Pars plicata des Ziliarkörpers (Abbildung 2) ist aus jedem der Quadranten mit Westcott Schere entfernt. Der Glaskörper Basis wird dann auf beiden Seiten der Ora serrata mit einer Pinzette über die pars plana und der Netzhaut (Abbildung 2) erfasst. Kontinuierliche Traktion auf den Glaskörper Basis ist mit der Zange angewendet. Sequential Schneiden mit Westcott Schere extrahiert eine semi-transparente Gewebe mit einer "Perlenkette" Erscheinungsbild, wie es ist herausgeschnitten. Die Probe wird dann in einem Mikrozentrifugenröhrchen und dann in flüssigem Stickstoff gelegt. 5. Vitreous Cortex Removal. Die Pars plana ist aus jedem der Quadranten mit Westcott Schere durch Abschneiden der Broschüre ca. 3-mm hinter der Ora serrata (Abb. 2) herausgeschnitten. Zwischen dem Gewebe Flugblätter, wird der Glaskörper Kortex visualisiert als halb transparente Folie. Die elastische Folie ist entweder mit 0,12 Pinzette gefaßt oder über die Zugehörigkeit zu einer Weck-Cel chirurgischen Schwamm. Der Glaskörper Kortex wird dann von der Netzhaut und zog ausgeschnitten mit Westcott Schere (Abbildung 1). Die Probe wird in einem Mikrozentrifugenröhrchen und dann in flüssigem Stickstoff gelegt. Alle Proben werden bei -80 ° C bis zum Experimentieren genutzt. 6. Repräsentative Ergebnisse Gewebeproben können durch eine Vielzahl von Methoden für bestimmte Experimente verarbeitet werden. In unserem Fall wurden die Proben für Protein-Analyse durch SDS-PAGE (Abbildung 3) vorgelegt. Abbildung 1. Querschnitt des menschlichen Auges darstellen verschiedenen Teilstrukturen des Glaskörpers. Die vorderen Glaskörper ist eine dünne kollagenen Schicht bezeichnet den vorderen hyaloidea. Der Glaskörper Kern umfasst das gesamte zentrale Bereich des Glaskörpers. Dieser Teil des Glaskörpers ist wässrigen im Gegensatz zu den Glaskörper Basis, die viskos genug, um mit einer Pinzette fassen und ist fest mit dem darunter liegenden Ziliarkörper und Retina befestigt ist. Umfasst den Glaskörper Kern ist eine sehr dünne kollagene Shell aufgerufen Glaskörper Kortex. Abbildung 2. Glaskörperbasis Anatomie. Der Glaskörper Basis ist eine semi-transparente Unterbau des Glaskörpers an der Ora serrata (weiße Pfeile), die die Trennlinie Trennung des Ziliarkörpers und der Netzhaut liegt. Der vordere Rand des Glaskörpers Basis erstreckt sich über die pars plana (weiße Linie) des Ziliarkörpers. Der hintere Rand des Glaskörpers Basis erstreckt 2-3 mm hinter der Ora serrata (weiß Bindestrich). Verbrauchsteuerpflichtige die Glaskörperbasis sind Pinzette verwendet, um das Gewebe zu erfassen und ziehen Sie sie weg von der zugrunde liegenden Ziliarkörper und Retina. Einmal erhöht, Westcott Schere werden verwendet, um an der Basis abgeschnitten. Abbildung 3. Eindimensionale SDS-PAGE des Glaskörpers Elements. Gesamt-Protein-Konzentrationen für den vorderen hyaloidea, Glaskörperbasis, vitreous Kern und Glaskörper Kortex wurden 11,24, 20,1, 16,61, 14,24 mg / ml. Gel-Elektrophorese wurde bei 200 kV für 45 Minuten durchgeführt, gefärbt mit Flamingo (Bio-Rad), und visualisiert mit Hilfe eines VersaDoc Imaging System (Bio-Rad). Die Profile für die verschiedenen Gewebe zeigen mehrere ähnliche Bands, aus der entweder konserviert oder Cross-kontaminierenden Proteinen, sowie einzigartige Bands (Stern), was darauf hinweist unterschiedlich lokalisierte Proteine.