Dissectie van de Mens glasvocht Elementen voor proteoomanalyse
Summary
Deze video toont een effectieve techniek voor het differentiëren en het ontleden van de verschillende semi-transparante structuren van het menselijk glasachtig lichaam in post mortem ogen.
Abstract
Het glasvocht is een optisch helder, collagene extracellulaire matrix dat de binnenkant van het oog en ligt over het netvlies vult. 1,2 Abnormale interacties tussen glasvocht en het netvlies onderbouw ten grondslag liggen aan verschillende vitreoretinale ziekten, waaronder retinale scheur en onthechting, macula pucker, maculair gaatje, leeftijdsgebonden maculaire degeneratie, vitreomaculaire tractie, proliferatieve vitreoretinopathie, proliferatieve diabetische retinopathie, en erfelijke vitreoretinopathies. 1,2 De moleculaire samenstelling van het glasvocht substructuren is niet bekend. Sinds het glasachtig lichaam is transparant met beperkte chirurgische toegang, is het moeilijk om haar substructuren studeren op moleculair niveau. We hebben een methode ontwikkeld om te scheiden en deze weefsels te bewaren voor proteomische en biochemische analyse. De dissectie techniek in deze experimentele video laat zien hoe te isoleren glasvocht basis, anterior hyaloid, glasachtige kern, en het glasvocht cortex van postmortale menselijke ogen. Eendimensionale SDS-PAGE analyses van elk onderdeel glasvocht toonde aan dat onze dissectie techniek resulteerde in vier unieke eiwitprofielen overeenkomt met elk onderbouw van het menselijk glasachtig lichaam. Identificatie van differentieel gecompartimenteerde eiwitten zal onthullen kandidaat-moleculen ten grondslag liggen aan de verschillende vitreoretinale ziekten.
Protocol
Discussion
Het glasachtig lichaam is een semi-transparante gel die de moleculaire samenstelling is slecht begrepen, vooral op het niveau van de onderbouw: het glasvocht basis, kern, cortex, en de voorste hyaloid. Het glasvocht kern bevat collageen II, V, IX, en XI, samen met chondroïtine sulfaat proteoglycanen, heparansulfaat proteoglycanen, en hyaluronan. 1,2 Eiwit biomarkers in het glasvocht kern zijn in verband gebracht met ziekten zoals diabetische retinopathie. 3-5 Hoe Deze eiwitten zijn differentieel tot expressie in elk van de substructuren, en in veel gevallen de specifieke eiwit identiteiten, zijn niet bekend. Deze gegevens kunnen inzicht geven in de herkomst van de eiwitten die in verband met specifieke vitreoretinale ziekten en helpen doelwit toekomstige therapieën. Hoewel de optimale post mortem interval voor weefsel dissectie is nog niet vastgesteld, kunnen afbraak van eiwitten beïnvloeden stroomafwaarts experimenten. Zo is bijvoorbeeld immunohistochemie beïnvloed in 12-uur postmortem ogen en een aantal specifiek enzym activiteiten kunnen worden teruggebracht binnen een paar uur (niet gepubliceerd observatie). Alle weefsels in deze studie werden verzameld tussen 2 en 8 uur van de dood, zonder significante veranderingen in eiwitexpressie of geschiktheid voor proteomics analsyis. De vloeibare stikstof bevriezen methode van conservering is verkozen boven fixatie om kleine veranderingen in de eiwitstructuur veroorzaakt door fixatief verknoping, die is in andere weefsels aangetoond door LC-MS/MS te voorkomen. 6 Proteoom studies zullen afhangen van het vermogen om nauwkeurig ontleden de verschillende compartimenten van het glasvocht, zoals aangetoond in deze video experiment. We hebben gekeken naar de dissectie techniek met behulp van een-dimensionale SDS-PAGE. Als onze resultaten suggereren, zijn er differentieel tot expressie gebrachte eiwitten in de verschillende substructuren glasachtig lichaam. Het identificeren van deze eiwitten zal een meer gedetailleerde kennis van glasvocht verkokering.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De financiering werd verstrekt door Fight for Sight. Weefsels werden verkregen van de Iowa Lions Eye Bank.
Materials
| Name | Company | Catalog Number |
| 0.12 forceps | Storz Ophthalmics | E1502 |
| 5-cc syringe | Becton-Dickinson | 309603 |
| Straight Dressing Forceps With Serrations | Storz Ophthalmics | E1400 |
| 23 gauge needle | Becton-Dickinson | 305145 |
| Colibri forceps | Storz Ophthalmics | 2/132 |
| Castroviejo angled corneal scissors | Storz Ophthalmics | E3223 |
| Vannas Curved Capsulotomy Scissors | Storz Ophthalmics | E3387 |
| Weck-Cel surgical spears | Medtronic | 0008680 |
| Westcott Curved Tenotomy Scissors | Storz Ophthalmics | E3320 |
References
- Bishop, P. N. Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel. Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).
- Sebag, J. Molecular biology of pharmacologic vitreolysis. Trans Am Ophthalmol Soc. 103, 473-494 (2005).
- Yoshimura, T. Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases. PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).
- Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy. J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).
- Izuta, H. Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients. Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).
- Azimzadeh, O. Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics. J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).
