Aktif Kemik İliği türetilen Makrofajlar ve Bradyzoite Koşullar Toxoplasma gondii Kist Duvar Oluşumu
Summary
Toxoplasma gondii doku kültürü modelleri taklit edilebilmektedir çevresel strese yanıt olarak bir kist formuna dönüşür. Bu video makrofajlar kemik iliği kaynaklı aktive veya fibroblast hücreleri büyüme orta pH değerini değiştirerek kist oluşumunu incelemek için teknikler gösterilmiştir.
Abstract
Toxoplasma gondii zorunlu hücre içi parazit, sıcak kanlı hayvanların herhangi bir çekirdekli hücre istila edebilir . Enfeksiyon sırasında, T. hızlı kopyalayan bir form tachyzoite denilen gondii yaymaktadır. Tachyzoites iyi karakterize bir sinyal işlem tarafından bradyzoite adında bir yavaş büyüyen encysted formu dönüştürmek. Hayvanlar içinde merkezi sinir sistemi ve kas dokusu, bradyzoite kist bulundu ve kronik enfeksiyon aşamasını temsil. Bradyzoites Dönüşüm yüksek pH ya da interferon gamma (IFNγ) yanı sıra orta kullanarak CO 2 açlık doku kültürü simüle edilebilir. Bradyzoites lektin Dolichos tohumları biflorus agglutinin (DBA) bağlayan bir kist duvarının varlığı ile karakterizedir. Floresan ile işaretlenmiş DBA düşük CO 2 ve yüksek pH ortamı maruz kalmış insan sünnet derisi fibroblastlar (paketleme) yetiştirilen parazitler kist görselleştirmek için kullanılmaktadır. Benzer şekilde, parazitler BMMs IFNγ ve lipopolisakkarid (LPS) ile aktive edildikten sonra iliği kaynaklı makrofajlar (BMMs) DBA tarafından algılanamaz bir kist görüntülemek fare kemik ikamet eden. Bu protokol, T. dönüşüm nasıl ikna etmek için ortaya koyacak BMMs düşük CO 2 ve aktivasyon ile yüksek pH besi kullanarak bradyzoites gondii. Konak hücrelerine lamelleri üzerinde kültüre tachyzoites ile enfekte ve ya IFNγ ve LPS (BMMs) eklenmesi ile aktif veya üç gün boyunca yüksek pH büyüme orta (paketleme) maruz olacaktır. Enfeksiyon tamamlanmasından sonra, konak hücreleri, sabit permeabilize, ve bloke olacaktır. Kist duvarları floresan mikroskobu ile rodamin DBA kullanılarak görüntülendi.
Protocol
Discussion
T. bradyzoite kalkınma mekanizması tam olarak anlaşılamamış olmakla birlikte, moleküler genetik analizler gondii doku kültüründe sahne dönüşüm bradyzoite kist oluşumu 2,3,4 yer alan genlerin keşfi yol açmıştır. Analizler de bradyzoite bazı işaretleri aktive makrofajlar 5,6 büyüme de dahil olmak üzere diğer uzun süreli stres koşullarına, ifade olduğunu gözleme açtı. Yukarıdaki yöntemlerden T. nasıl yetiştirileceğini tarif gondii</e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | heat inactivate | |
| Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin | Vector Laboratories | RL-1032 | ||
| Formaldehyde (16%) | Polysciences | 18814 | ||
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | ||
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | ||
| IFNγ | PeproTech | 315-05 | Store in single use aliquots | |
| L-glutamine (200mM) | Gibco | 25030 | ||
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391-1MG | Store in single use aliquots | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate) | Gibco | 31800-022 | ||
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200 | ||
| VectaShield mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).
- Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S. Identification and characterization of differentiation mutants in the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 44, 735-747 (2002).
- Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction. Mol Microbiol. 44, 721-733 (2002).
- J, P., Knoll, L. J. Isolation of Toxoplasma gondii development mutants identifies a potential proteophosphogylcan that enhances cyst wall formation. Molecular and Biochemical Parasitology. 169 (2), 120-123 (2010).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of Bradyzoite-Specific Toxoplasma gondii Antigens in Gamma Interferon-Treated Mouse Macrophages. Infection and Immunity. 61 (3), 1141-1145 (1993).
- Ibrahim, H. M., Bannai, H., Xuan, X., Nishikawa, Y. Toxoplasma gondii Cyclophilin 18-Mediated Production of Nitric Oxide Induces Bradyzoite Conversion in a CCR5-Dependent Manner. Infection and Immunity. 77 (9), 3686-3695 (2009).
- Lyons, R. E., McLeod, R., Roberts, C. W. Toxoplasma gondii tachyzoite-bradyzoite interconversion. Trends in Parasitology. 18 (5), 198-201 (2002).
- Berghaus, L. J., Moore, J. N., Hurley, D. J., Vandenplas, M. L., Fortes, B. P., Wolfert, M. A., Boons, G. J. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. , (2009).
- Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infection and Immunity. 62 (5), 1761-1777 (1994).
