Toxoplasma gondii Formação parede do cisto no Activated derivadas da medula óssea macrófagos e Condições Bradyzoite
Summary
Toxoplasma gondii se converte em uma forma de cisto em resposta ao estresse ambiental, que pode ser imitada em modelos de cultura de tecidos. Este vídeo demonstra técnicas para examinar a formação de parede do cisto, ativando derivadas da medula óssea macrófagos ou alterar o pH de crescimento médio em células de fibroblastos.
Abstract
Toxoplasma gondii é um parasita intracelular obrigatório que pode invadir qualquer célula nucleada de animais de sangue quente. Durante a infecção, T. gondii dissemina como uma forma rápida replicação chamado tachyzoite. Taquizoítos converter em uma forma de crescimento lento encistados chamado bradyzoite por um processo de sinalização que não está bem caracterizada. Dentro de animais, cistos bradyzoite são encontradas no sistema nervoso central e tecido muscular e representam a fase crônica da infecção. Conversão para bradyzoites pode ser simulada em cultura de tecidos por inanição CO 2, utilizando meio com pH elevado, ou a adição de interferon gama (IFNγ). Bradyzoites são caracterizadas pela presença de uma parede do cisto, a que a lectina Dolichos biflorus aglutinina (DBA) liga. DBA fluorescente etiquetado é usado para visualizar a parede do cisto no parasitas cultivados em fibroblastos humanos prepúcio (HFFS) que tenham sido expostos a baixa emissão de CO 2 e pH médio alto. Da mesma forma, os parasitas que residem no óssea de camundongos derivadas da medula macrófagos (BMMs) exibir uma parede do cisto detectáveis por DBA após o BMMs são ativados com IFNγ e lipopolissacarídeo (LPS). Este protocolo irá demonstrar como induzir a conversão de T. gondii para bradyzoites usando um meio de crescimento elevado pH, com baixa de CO 2 e ativação de BMMs. Células do hospedeiro serão cultivadas em lamínulas, infectados com taquizoítos e quer ativado com adição de IFNγ e LPS (BMMs) ou expostos a um meio de alto pH de crescimento (HFFS) por três dias. Após a conclusão de infecções, células hospedeiras será corrigido, permeabilizadas, e bloqueado. Paredes do cisto será visualizado utilizando rodamina DBA com microscopia de fluorescência.
Protocol
Discussion
Embora o mecanismo de desenvolvimento bradyzoite não é totalmente compreendido, molecular análises genéticas de T. gondii estágio de conversão em cultura de tecidos tem levado à descoberta de genes que estão envolvidos na formação de cistos bradyzoite 2,3,4. As análises também levaram à observação de que alguns marcadores bradyzoite são expressas em outras condições de estresse prolongado, incluindo o crescimento em macrófagos ativados 5,6. Os métodos acima descrevem co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | heat inactivate | |
| Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin | Vector Laboratories | RL-1032 | ||
| Formaldehyde (16%) | Polysciences | 18814 | ||
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | ||
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | ||
| IFNγ | PeproTech | 315-05 | Store in single use aliquots | |
| L-glutamine (200mM) | Gibco | 25030 | ||
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391-1MG | Store in single use aliquots | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate) | Gibco | 31800-022 | ||
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200 | ||
| VectaShield mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).
- Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S. Identification and characterization of differentiation mutants in the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 44, 735-747 (2002).
- Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction. Mol Microbiol. 44, 721-733 (2002).
- J, P., Knoll, L. J. Isolation of Toxoplasma gondii development mutants identifies a potential proteophosphogylcan that enhances cyst wall formation. Molecular and Biochemical Parasitology. 169 (2), 120-123 (2010).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of Bradyzoite-Specific Toxoplasma gondii Antigens in Gamma Interferon-Treated Mouse Macrophages. Infection and Immunity. 61 (3), 1141-1145 (1993).
- Ibrahim, H. M., Bannai, H., Xuan, X., Nishikawa, Y. Toxoplasma gondii Cyclophilin 18-Mediated Production of Nitric Oxide Induces Bradyzoite Conversion in a CCR5-Dependent Manner. Infection and Immunity. 77 (9), 3686-3695 (2009).
- Lyons, R. E., McLeod, R., Roberts, C. W. Toxoplasma gondii tachyzoite-bradyzoite interconversion. Trends in Parasitology. 18 (5), 198-201 (2002).
- Berghaus, L. J., Moore, J. N., Hurley, D. J., Vandenplas, M. L., Fortes, B. P., Wolfert, M. A., Boons, G. J. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. , (2009).
- Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infection and Immunity. 62 (5), 1761-1777 (1994).
