Toxoplasma gondii parete formazione di cisti in attivo dal midollo osseo macrofagi e condizioni Bradyzoite
Summary
Toxoplasma gondii converte in una forma cisti in risposta a stress ambientali, che può essere imitato in modelli di colture di tessuti. Questo video mostra le tecniche per esaminare la formazione di cisti muro attivando midollo osseo macrofagi o modificare il pH medio di crescita in cellule di fibroblasti.
Abstract
Toxoplasma gondii è un parassita intracellulare obbligato che possono infettare ogni cellula nucleata di animali a sangue caldo. Durante l'infezione, T. gondii diffonde come una forma veloce replicando chiamato tachizoite. Tachizoiti convertire in una lenta crescita forma incistata chiamato bradyzoite da un processo di segnalazione che non è ben caratterizzato. All'interno di animali, cisti bradyzoite si trovano nel sistema nervoso centrale e del tessuto muscolare e rappresentano la fase cronica di infezione. Conversione in bradyzoites può essere simulato in coltura da CO 2 fame, utilizzando medio alta con un pH, o l'aggiunta di interferone gamma (IFNγ). Bradyzoites sono caratterizzate dalla presenza di un muro di cisti, a cui la lectina Dolichos biflorus agglutinina (DBA) si lega. DBA fluorescente viene utilizzato per visualizzare le cisti di parassiti muro cresciuto in fibroblasti umani prepuzio (HFFS) che sono stati esposti a basse emissioni di CO 2 e medio alto pH. Allo stesso modo, i parassiti che risiedono nel midollo osseo murino di derivazione macrofagi (BMMs) visualizzare una parete cisti rilevabile dal DBA dopo la BMMs sono attivate con IFNγ e lipopolisaccaride (LPS). Questo protocollo verrà illustrato come indurre la conversione di T. gondii a bradyzoites utilizzando un mezzo di crescita elevati pH con 2 CO bassa e l'attivazione di BMMs. Cellule ospiti saranno coltivati su vetrini, infettati con tachizoiti e sia attivato con aggiunta di IFNγ e LPS (BMMs) o esposti a una media di crescita elevato pH (HFFS) per tre giorni. Al termine delle infezioni, cellule ospiti sarà fissato, permeabilizzate, e bloccato. Pareti cisti verrà visualizzato usando DBA rodamina con microscopia a fluorescenza.
Protocol
Discussion
Mentre il meccanismo di sviluppo bradyzoite non è pienamente compreso, analisi di genetica molecolare di T. stadio di conversione gondii in colture di tessuti ha portato alla scoperta di geni che sono coinvolti nella formazione di cisti bradyzoite 2,3,4. Le analisi inoltre ha portato alla constatazione che alcuni marcatori bradyzoite sono espressi in altre condizioni di stress prolungato, tra cui la crescita in macrofagi attivati 5,6. I metodi sopra descrivono come far cres…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | heat inactivate | |
| Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin | Vector Laboratories | RL-1032 | ||
| Formaldehyde (16%) | Polysciences | 18814 | ||
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | ||
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | ||
| IFNγ | PeproTech | 315-05 | Store in single use aliquots | |
| L-glutamine (200mM) | Gibco | 25030 | ||
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391-1MG | Store in single use aliquots | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate) | Gibco | 31800-022 | ||
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200 | ||
| VectaShield mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).
- Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S. Identification and characterization of differentiation mutants in the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 44, 735-747 (2002).
- Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction. Mol Microbiol. 44, 721-733 (2002).
- J, P., Knoll, L. J. Isolation of Toxoplasma gondii development mutants identifies a potential proteophosphogylcan that enhances cyst wall formation. Molecular and Biochemical Parasitology. 169 (2), 120-123 (2010).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of Bradyzoite-Specific Toxoplasma gondii Antigens in Gamma Interferon-Treated Mouse Macrophages. Infection and Immunity. 61 (3), 1141-1145 (1993).
- Ibrahim, H. M., Bannai, H., Xuan, X., Nishikawa, Y. Toxoplasma gondii Cyclophilin 18-Mediated Production of Nitric Oxide Induces Bradyzoite Conversion in a CCR5-Dependent Manner. Infection and Immunity. 77 (9), 3686-3695 (2009).
- Lyons, R. E., McLeod, R., Roberts, C. W. Toxoplasma gondii tachyzoite-bradyzoite interconversion. Trends in Parasitology. 18 (5), 198-201 (2002).
- Berghaus, L. J., Moore, J. N., Hurley, D. J., Vandenplas, M. L., Fortes, B. P., Wolfert, M. A., Boons, G. J. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. , (2009).
- Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infection and Immunity. 62 (5), 1761-1777 (1994).
