Toxoplasma gondii Cyste muur Vorming in actieve beenmerg afgeleide Macrofagen en Bradyzoite voorwaarden
Summary
Toxoplasma gondii wordt omgezet in een cyste formulier in reactie op belasting van het milieu, die kunnen worden nagebootst in weefselkweek modellen. Deze video demonstreert technieken om cyste wand vorming van onderzoeken door het activeren van beenmerg afgeleide macrofagen of het wijzigen van groeimedium pH in fibroblast cellen.
Abstract
Toxoplasma gondii is een obligaat intracellulaire parasiet dat elke kern cel van warmbloedige dieren kunnen binnenvallen. Tijdens de infectie, T. gondii verspreidt als een snel repliceren vorm genaamd de tachyzoite. Tachyzoites om te zetten in een langzaam groeiende ingekapseld vorm genaamd de bradyzoite door een signalering proces dat niet goed is gekarakteriseerd. Binnen de dieren, zijn bradyzoite cysten gevonden in het centrale zenuwstelsel en spierweefsel en vormen de chronische fase van de infectie. Conversie naar bradyzoites gesimuleerd kan worden in weefselkweek door CO 2 verhongering, met behulp van een medium met een hoge pH-waarde, of de toevoeging van interferon-gamma (IFNy). Bradyzoites worden gekenmerkt door de aanwezigheid van een cyste wand, waarop de lectine Dolichos biflorus agglutinine (DBA) bindt. Fluorescent gelabelde DBA wordt gebruikt om de cyste muur in parasieten gekweekt in menselijke voorhuid fibroblasten (HFFS) die zijn blootgesteld aan lage CO 2 en een hoge pH medium te visualiseren. Ook parasieten die in muizen beenmerg afgeleide macrofagen (BMMs) display een cyste wand detecteerbaar door DBA na de BMMs worden geactiveerd met IFNy en lipopolysaccharide (LPS). Dit protocol zal aantonen hoe de conversie van T. te induceren gondii naar bradyzoites met behulp van een hoge pH groeimedium met een lage CO 2 en activering van BMMs. Gastheercellen worden gekweekt op dekglaasjes, besmet zijn met tachyzoites en ofwel geactiveerd met toevoeging van IFNy en LPS (BMMs) of blootgesteld aan een hoge pH groeimedium (HFFS) voor drie dagen. Na voltooiing van infecties, zal gastheercellen worden vastgesteld, gepermeabiliseerde, en geblokkeerd. Cyste wanden zullen worden gevisualiseerd met behulp van rhodamine DBA met fluorescentie microscopie.
Protocol
Discussion
Hoewel het mechanisme van bradyzoite ontwikkeling is niet volledig begrepen, moleculair genetische analyses van T. gondii stadium conversie in weefselkweek heeft geleid tot de ontdekking van genen die betrokken zijn bij bradyzoite cyste vorming van 2,3,4. De analyses ook geleid tot de observatie dat sommige bradyzoite markers zijn uitgedrukt in andere langdurige stress voorwaarden, waaronder de groei van geactiveerde macrofagen 5,6. De bovenstaande methoden wordt beschreven hoe T.…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | heat inactivate | |
| Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin | Vector Laboratories | RL-1032 | ||
| Formaldehyde (16%) | Polysciences | 18814 | ||
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | ||
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | ||
| IFNγ | PeproTech | 315-05 | Store in single use aliquots | |
| L-glutamine (200mM) | Gibco | 25030 | ||
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391-1MG | Store in single use aliquots | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate) | Gibco | 31800-022 | ||
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200 | ||
| VectaShield mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).
- Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S. Identification and characterization of differentiation mutants in the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 44, 735-747 (2002).
- Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction. Mol Microbiol. 44, 721-733 (2002).
- J, P., Knoll, L. J. Isolation of Toxoplasma gondii development mutants identifies a potential proteophosphogylcan that enhances cyst wall formation. Molecular and Biochemical Parasitology. 169 (2), 120-123 (2010).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of Bradyzoite-Specific Toxoplasma gondii Antigens in Gamma Interferon-Treated Mouse Macrophages. Infection and Immunity. 61 (3), 1141-1145 (1993).
- Ibrahim, H. M., Bannai, H., Xuan, X., Nishikawa, Y. Toxoplasma gondii Cyclophilin 18-Mediated Production of Nitric Oxide Induces Bradyzoite Conversion in a CCR5-Dependent Manner. Infection and Immunity. 77 (9), 3686-3695 (2009).
- Lyons, R. E., McLeod, R., Roberts, C. W. Toxoplasma gondii tachyzoite-bradyzoite interconversion. Trends in Parasitology. 18 (5), 198-201 (2002).
- Berghaus, L. J., Moore, J. N., Hurley, D. J., Vandenplas, M. L., Fortes, B. P., Wolfert, M. A., Boons, G. J. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. , (2009).
- Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infection and Immunity. 62 (5), 1761-1777 (1994).
