التوكسوبلازما جدار الكيس الغوندية تشكيل المنشط تقوم البلاعم في نخاع العظام والمستمدة من الشروط المتباطئة
Summary
المقوسة الغوندية يحول الى شكل كيس ردا على الضغوط البيئية ، والتي يمكن في نماذج تحاكي زراعة الأنسجة. هذا الفيديو يوضح التقنيات لدراسة تشكيل جدار الكيس عن طريق تنشيط نخاع العظام المستمدة الضامة أو تغيير درجة الحموضة المتوسطة النمو في الخلايا الليفية.
Abstract
المقوسة الغوندية هو طفيلي تلزم بين الخلايا التي يمكن أن تغزو أي خلية الأنوية من الحيوانات من ذوات الدم الحار. خلال العدوى ، T. كما تنشر الغوندية شكل سريع تكرار يسمى tachyzoite. Tachyzoites تحويلها الى شكل بطيء النمو المتباطئة متكيس يسمى بعملية الإشارات التي لا تتميز بشكل جيد. داخل الحيوانات ، تم العثور على أكياس المتباطئة في النظام العصبي المركزي والأنسجة العضلية وتمثل المرحلة المزمنة من المرض. يمكن تحويلها إلى bradyzoites تكون محاكاة في مجال زراعة الأنسجة عن طريق التجويع CO 2 ، وذلك باستخدام المتوسطة مع الحموضة عالية ، أو إضافة انترفيرون غاما (IFNγ). تتميز Bradyzoites عن وجود جدار الكيس ، والتي lectin Dolichos biflorus راصة (DBA) بربط. يستخدم DBA fluorescently المسمى لتصور جدار الكيس في الطفيليات التي تزرع في الخلايا الليفية الإنسان القلفة (HFFs) التي تعرضت لانخفاض CO 2 ، وارتفاع متوسط درجة الحموضة. وبالمثل ، والطفيليات المقيمين في نخاع العظام المستمدة من الفئران الضامة (BMMs) عرض الحائط كيسة كشفها بواسطة DBA بعد تنشيط BMMs مع IFNγ وlipopolysaccharide (LPS). وهذا البروتوكول لشرح كيفية إحداث تحويل T. الغوندية لbradyzoites باستخدام الرقم الهيدروجيني نمو عالية متوسطة منخفضة مع CO 2 وتفعيل BMMs. وسيتم تربيتها في الخلايا المضيفة coverslips ، tachyzoites المصابين هم من يمكنهم إما مع اضافة IFNγ وLPS (BMMs) أو تعرضها لدرجة الحموضة المتوسطة النمو العالية (HFFs) لمدة ثلاثة أيام. عند الانتهاء من العدوى ، وسوف تكون ثابتة الخلايا المضيفة ، permeabilized ، وحظرها. وسيتم استخدام الجدران كيسة تصور DBA رودامين مع المجهري مضان.
Protocol
Discussion
في حين ليست آلية التنمية المتباطئة مفهومة تماما ، والتحليلات الجينية الجزيئية ت. وقد أدى الغوندية مرحلة التحويل في مجال زراعة الأنسجة إلى اكتشاف الجينات التي تشارك في تشكيل كيسة المتباطئة 2،3،4. التحليلات أدى أيضا إلى ملاحظة أن يتم التعبير عن بعض علام?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bovine serum albumin | Sigma | A7906 | ||
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | Gibco | 11960-051 | ||
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | heat inactivate | |
| Rhodamine Dolichos biflorus agglutinin | Vector Laboratories | RL-1032 | ||
| Formaldehyde (16%) | Polysciences | 18814 | ||
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | ||
| HEPES | Fisher Scientific | BP310-1 | ||
| IFNγ | PeproTech | 315-05 | Store in single use aliquots | |
| L-glutamine (200mM) | Gibco | 25030 | ||
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L4391-1MG | Store in single use aliquots | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-545-80 12CIR-1 | ||
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140 | ||
| RPMI medium 1640 powder (with L-glutamine, without bicarbonate) | Gibco | 31800-022 | ||
| Triton-X-100 | Fisher Scientific | BP151-500 | ||
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25200 | ||
| VectaShield mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 |
References
- Tomida, M., Yamamoto-Yamaguchi, Y., Hozumi, M. Purification of a factor inducing differentiation of mouse myeloid leukemic M1 cells from conditioned medium of mouse fibroblast L929 cells. J Biol Chem. 259 (17), 10978-10980 (1984).
- Matrajt, M., Donald, R. G., Singh, U., Roos, D. S. Identification and characterization of differentiation mutants in the protozoan parasite Toxoplasma gondii. Mol Microbiol. 44, 735-747 (2002).
- Singh, U., Brewer, J. L., Boothroyd, J. C. Genetic analysis of tachyzoite to bradyzoite differentiation mutants in Toxoplasma gondii reveals a hierarchy of gene induction. Mol Microbiol. 44, 721-733 (2002).
- J, P., Knoll, L. J. Isolation of Toxoplasma gondii development mutants identifies a potential proteophosphogylcan that enhances cyst wall formation. Molecular and Biochemical Parasitology. 169 (2), 120-123 (2010).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Induction of Bradyzoite-Specific Toxoplasma gondii Antigens in Gamma Interferon-Treated Mouse Macrophages. Infection and Immunity. 61 (3), 1141-1145 (1993).
- Ibrahim, H. M., Bannai, H., Xuan, X., Nishikawa, Y. Toxoplasma gondii Cyclophilin 18-Mediated Production of Nitric Oxide Induces Bradyzoite Conversion in a CCR5-Dependent Manner. Infection and Immunity. 77 (9), 3686-3695 (2009).
- Lyons, R. E., McLeod, R., Roberts, C. W. Toxoplasma gondii tachyzoite-bradyzoite interconversion. Trends in Parasitology. 18 (5), 198-201 (2002).
- Berghaus, L. J., Moore, J. N., Hurley, D. J., Vandenplas, M. L., Fortes, B. P., Wolfert, M. A., Boons, G. J. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors 2, 3, and 4. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. , (2009).
- Mordue, D. G., Scott-Weathers, C. F., Tobin, C. M., Knoll, L. J. A patatin-like protein protects Toxoplasma gondii from degradation in activated macrophages. Mol Microbiol. 63 (2), 482-496 (2007).
- Bohne, W., Heesemann, J., Gross, U. Reduced replication of Toxoplasma gondii is necessary for induction of bradyzoite-specific antigens: a possible role for nitric oxide in triggering stage conversion. Infection and Immunity. 62 (5), 1761-1777 (1994).
